摘 要

为了能够使用靶向分子治疗急性淋巴细胞白血病，适配体，一类由核糖核酸或单链的脱氧核糖核酸寡核苷酸组成的，且对靶点FLT3有高特异性与亲和性的小型配体，在过去的的几年中被广泛应用。适配体因其非免疫原性，高效率以及热稳定性而具有良好的应用前景。 但是由于技术并不成熟，人们需要依靠SELEX技术来合成适配体，SELEX是一种基于重复扩增和富集过程。SELEX过程带来的巨大成本使得生产适配体更加困难，也限制了其发展。为了减少SELEX过程带来的成本，本设计通过分析与改造已有的结构来为以后研究不用SELEX方法制备适配体的系统提供条件。本设计拟通过以已有的适配体Sgc8c为模板改造而得基本结构，之后分析基本结构并且引入变量的方法来设计适配体。在分析了三种不同的RNA结构之后，最后得出根据不同情况应按照其结构选用不同的序列的结果。

关键词：适配体；靶向；RNA；非SELEX；FLT-3；急性淋巴细胞白血病

Abstract

In order to treat acute lymphoblastic leukemia with target molecule, aptamer, a class of small nucleic acid ligands that are composed of RNA or single-stranded DNA oligonucleotides and have high specificity and affinity for their target- FLT-3, has been widely used in the last few years. Aptamers have great prospects for its non-immunogenicity, efficiency and stability. However, since the technology being immature, people have to form aptamers through the SELEX process, which is based on a repetitive amplification and enrichment process. The huge production cost brought by SELEX makes it tougher to produce aptamer. And it indeed limited the development of aptamer. To reduce the cost brought by SELEX, this design provides a possibility for further study of a way to synthesize aptamer without using SELEX by analyzing and reform the structure we already have.Modified Sgc8c (an aptamer) being model, this paper tries to analyze and use variables to design aptamers. After analyzed 3 different RNA structures, the conclusion comes that different structures should be chosen under different circumstances.

Key words：aptamers; targeting; RNA; without SELEX; FLT-3; ALL

第1章 绪论

1.1急性淋巴细胞白血病（ALL）简介

急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是一种淋巴系血液细胞显著特征为大量未成熟淋巴细胞的发育，并致使人体造血功能衰竭免疫功能下降的恶性肿瘤疾病^[1]，图一向我们展示了骨髓中的干细胞分化为各种血细胞的结果，还有正常情况下与白血病情况下的比较。

图一 A)骨髓发展成各种血细胞的过程 B)正常血细胞 C)白血病情况下的细胞

ALL的症状可能包括感觉疲倦、肤色苍白、发烧、容易出血或瘀伤、淋巴结肿大或骨痛。作为一种急性白血病，ALL发展迅速，如果不加以治疗的话，通常在几周或几个月内即可致命。ALL对人类健康的危害尤其是儿童的健康危害极为严重。

尽管如此严重，治疗急性淋巴细胞白血病的药物却始终面临生物利用度低、对正常细胞毒副作用大这两个临床治疗上的共性问题。而为了解决此类问题，就需要使药物靶向地作用于病变细胞^[2][3]。以这种方式维持病变细胞周围的药物浓度同时减少其他地方的药物浓度。从而使药物少作用甚至不作用于正常的人体细胞。

1.2靶向分子简介

分子靶向药物主要是以疾病的关键靶点为目标来有目的性的释放药物。其在癌症治疗方面起作用尤其明显。一些分子靶向药物在相应的肿瘤治疗中显示出更好的疗效^[4]。尽管分子靶向药物对肿瘤的作用更为突出，具有良好的耐受性和温和的毒性。但人们普遍认为，传统的细胞毒性抗肿瘤药物在相当长的一段时间内不能完全被替代。而这些药物的共同使用更为普遍。两者的结合使用是目前比较普遍的应用方式。这也对该类药物的个体化治疗提出了更高的要求。药物靶分子在治疗前后的表达和突变往往决定了分子靶向药物的治疗效果。

1.2.1特异性靶向分子简介

在治疗剂量下，仅特异性地作用于某单个靶点的靶向分子称特异性靶向分子。比如伊马替尼。伊马替尼通过阻断BCR-ABL酪氨酸激酶发挥作用^[5]。通过其阻断作用，伊马替尼能选择性减缓Bcr-Abl阳性细胞、Ph染色体阳性的慢性粒细胞白血病和急性淋巴细胞白血病患者的新鲜细胞的增殖并诱导其程序性死亡。

1.2.2非特异性靶向分子简介

相比较于特异性靶向分子，在治疗剂量下，同时作用于多个靶点的药物称非特异性靶向分子。例如舒尼替尼。舒尼替尼及其体内代谢产物为小分子多靶点受体酪氨酸激酶（RTK）抑制剂，^[6]可抑制血小板衍生生长因子受体-α/β（PDGFR-α/β、血管内皮生长因子受体-1/2/3（VEGFR-1/2/3）、干细胞因子受体(KIT)、FmS样酪氨酸激酶-3（FLT-3）、1型集落刺激因子受体（CSF-1R）和胶质细胞源性神经营养因子受体（RET）。通过抑制PDGFR、RET或KIT等靶点介导的肿瘤细胞生长以及PDGFR-β和VEGFR-2依赖的肿瘤血管新生作用产生抗肿瘤作用。

1.2.3抗体简介

抗体又称作免疫球蛋白。抗体是一种大型的，由四条多肽链组成，各肽链之间以数量不等的链间二硫键连接，最终形成“Y”字型结构的蛋白质。它主要由浆细胞产生，并在免疫系统中担任中和病原体（比如病原细菌和病毒）的工作。抗体通过Fab的可变区识别抗原进行特异性结合。它的“Y”型结构每一个末端具有一个特殊的空间结构。这个结构与抗原上的一个特定位置能够进行识别与结合，就好像一个钥匙配上一把锁一般。自1986年第一个治疗性抗体进入临床以来，治疗性抗体得到了迅速的发展。

1.3适配体简介

适配体是一小段经体外筛选得到的寡核苷酸序列或者短的多肽。其实核糖开关中也有天然存在的适配体。适配体以其特殊的三维结构通过结构识别与其靶点互相作用，从而与相应的配体进行高亲和力和强特异性的结合。适配体的诞生为生物医学界和化学生物学界提供了一种新的高效高速识别的研究平台。并且由于适配体能够特异性识别多种靶点，比如离子、药物、肽链、蛋白质、病毒、细菌、细胞甚至是组织，所以其也在许多方面显示出了十分良好的应用前景。通常来说，适配体的应用都伴随着使用指数富集配体系统进化技术(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)合成的步骤。SELEX技术^[7][8][9]是一种基于重复扩增和富集过程，用于开发针对人们感兴趣的特异性目标的适配体的方法。SELEX过程需要：首先，化学合成一个包含10^14至10^15个独特的随机序列，然后将这些随机的序列与包含着我们需要的靶点的结构混合来筛选出可以结合的序列，并弃去不能结合的序列。这之后再将此序列扩增并通过反选择去掉那些并不是和靶点结合而是和其他地方结合的序列。再之后开始下一轮的选择。最终，适配体的选择会经历4到20轮的扩增和富集。由于序列是无目的地随机合成的，而有用的序列又是少之又少，所以SELEX过程会耗费大量的人力物力。

1.3.1多肽适配体简介

尽管适配体的作用方式与抗体类似，并且实际上核酸适配体本身也被称之为“化学抗体”。但多肽适配体与抗体并不相同。即使多肽适配体的化学本质是多肽，而抗体的化学本质也是类似的蛋白质。适配体在特异性结合方面的性能更优于抗体，正如其拉丁文词源（aptus，意为“量体裁衣”）一样，适配体具有更好的选择性。并且适配体的体积要比蛋白质抗体更小，（适配体约8-25kDa而抗体约150kDa）使其能够具有更好的渗透性。

1.3.2 核糖核酸适配体简介

由于其化学本质的缘故，多肽容易被体内的免疫系统识别为抗原，从而遭到免疫系统的攻击。为了克服这个困难，核糖核酸（RNA）适配体便应运而生。从原则上来说，鉴于核糖核酸（RNA）适配体实质上是寡核苷酸，那么它应该不会被免疫系统识别。并且之后的临床试验也证实了在在体情况下适配体并不会激活免疫反应。与蛋白质抗体相比较，尤其是在反复注射之后，适配体可以说是具有高度非免疫原性了。并且核酸适配体还有一个好处，就是其热稳定性要好过蛋白质。即使在95摄氏度条件下使其变性之后，一旦冷却至室温，适配体依然能够重新折叠至其正确的三维结构。而我们都知道蛋白质在高温条件下其三维结构会遭到不可逆的破坏，从而导致永久失活。

1.3.3 脱氧核糖核酸适配体简介

RNA适配体看似各方性能都很优良，但是它并不是一块无瑕的白璧，核糖核酸（RNA）适配体确实也有其美中不足之处：那就是核糖核酸（RNA）序列却对生物环境中的核酸酶非常敏感，并且可以被迅速降解。人们研究了一些方法来降低RNA适配体被降解的速度，但是与此同时也在寻求新的出路。脱氧核糖核酸（DNA）适配体就是所谓的新的出路。相比起核糖核酸（RNA）适配体，脱氧核糖核酸（DNA）适配体具有更加优秀的稳定性。实验表明^[10]某种DNA适配体即使在浓度低至2 nmol/l展时依然现出了对其靶点的高亲和性，并且在人的血清中稳定长达8小时。相对地，在相似的条件下，针对相同靶点的核糖核酸（RNA）适配体在十分钟内就被分解了。同时比起核糖核酸（RNA）适配体，脱氧核糖核酸（DNA）适配体也具有较为简单的筛选过程。

1.3.4 RNA适配体与DNA适配体的比较

尽管相对于核糖核酸（RNA）适配体而言，脱氧核糖核酸（DNA）适配体的稳定性确实优良很多，但是人们并没有就此放弃对于RNA适配体的研究与开发或摒弃RNA适配体转而专心研究DNA适配体。实际上核糖核酸（RNA）适配题依然是适配体家族中十分重要的一个角色。因为其化学结构的原因，核糖核酸（RNA）的单链结构使其比起双螺旋的脱氧核糖核酸（DNA）在空间结构上拥有更多可能性。上文中也说过了，适配体又被称作“化学抗体”，因为其主要功能是通过特殊的三维结构与靶点相互作用，所以核糖核酸（RNA）的寡核苷酸链比起脱氧核糖核酸（DNA）寡核苷酸链来说本质上更加适合也更能升任适配体的工作。本设计也同样选择使用核糖核酸（RNA）适配体。

1.4靶点FLT-3

FLT3（Fms-like tyrosine kinase, FMS样的酪氨酸激酶3）是一种由人的FLT3基因编码的蛋白质，它属于III型受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase III, RTK III）。酪氨酸蛋白激酶( protein tyrosine kinase，PTK) 是一类催化细胞的基础供能物质三磷酸腺苷（Adenosine TriPhosphate）上γ-磷酸转移到蛋白酪氨酸残基上的激酶。酪氨酸蛋白激酶能催化多种底物蛋白质酪氨酸残基磷酸化。酪氨酸蛋白激酶在细胞生长、增殖、分化中具有重要作用。它主要有受体型和非受体型。经过大量实验研究，人们发现受体型酪氨酸蛋白激酶是具有促进细胞增殖的功能的，并且该激酶表达量会在肿瘤细胞中显著增加。这个现象预示着受体型酪氨酸蛋白激酶极有可能是与肿瘤细胞增殖相关^[11]。细胞因子FLT3配体（FLT3L）的受体编码为CD135，这个蛋白质就是本设计的靶点。因为在过去的几年之中，许多大样本研究已经证实了FLT3的激活和突变在白血病的发生还有白血病的发展过程中均起到了十分重要的病理作用^[12]。FLT-3蛋白质的第27-543个氨基酸是其胞外结构，544-563号氨基酸是一段螺旋的跨膜结构，而其564-993号氨基酸则是在细胞内的结构，我们主要研究的是FLT-3的胞外结构。

1.5本次设计目的

由于对急性淋巴细胞白血病的治疗药物生物利用度低、对正常细胞毒副作用大，所以本次设计的目的就是设计出具有高选择性，能与FLT3进行特异性结合的适配体。并且适配体需要具有一定的稳定性，不能在进入体内后就被立即分解。然后还不再通过SELEX随机合成核酸序列，而是有的放矢，在制作适配体之前先设计出一段大致的序列，然后只合成类似的序列。从而大大缩减序列样本的容量，削减成本。

第2章 实验设计依据

2.1设计要求

在已有的结构的基础之上来设计出核糖核酸（RNA）适配体。并且需要添加一些变量，从而使筛选的过程可以在一个较小的范围之内进行，而不是从成千上万的样本之中筛选出个位数的有用的核糖核酸。最终在核糖核酸（RNA）适配体的两端还可以进行修饰，添加荧光标记与载药系统。这样可以使设计出的适配体的功能更加全面。并且由于核酸分解酶的作用位点被占据，这样在两端添加别的东西也可以对核糖核酸起到一定的保护作用。

2.2设计依据

2.2.1靶点与靶向分子之间的相互作用关系

由于靶点的化学本质是蛋白质，而靶向分子的化学本质是核糖核酸，所以靶点与靶向分子之间的作用关系首先不会是二硫键。又因为构成的靶向分子核糖核酸的基本单位核糖核苷酸中包含着碱基，且碱基之间的相互作用包含了氢键，同时蛋白质形成二级结构也会依靠氢键的产生，所以靶点和靶向分子之间会有氢键相互作用。有部分构成靶点蛋白质的氨基酸包含着芳香残基，核糖核酸中碱基的π电子云就可以与其形成疏水相互作用。当核糖核酸与蛋白质分子靠近到一定距离时，分子间还会产生范德华力。

2.2.2靶点分析

经过查阅资料，得知^[13] FLT3蛋白质在细胞外的结构代号为3qs7，并且其三级结构如图二所示，其中粉色，紫色，暗黄色与红色的链ABCD为细胞因子，是这个FLT3受体的配体。而青色与黄色的链G与链H是同一结构的不同片段晶体，而且受体是多聚的形式的，所以形成这样的结构支撑。围绕在蛋白质周围的小分子则是N-ACETYL-D-GLUCOSAMINE （NAG，N-乙酰葡萄糖胺）是一个糖基化的修饰基团。所以我们的重点就放在蓝色与绿色的链E和链F上，以这个链为靶点片段。

a）

b)

图二 3qs9的三级结构以及组成其片段的各个部分 a)3qs9的三级结构 b)各个部分

进一步查阅资料^[14]可知FLT3上的靶点片段是由328个氨基酸所组成。它的氨基酸序列如下:AA 80 VEVDV SASIT LQVLV DAPGN 100 ISCLW VFKHS SLNCQ PHFGV VSMVI LKMTE TQAGE YLLFI QSTNY TILFT 150 VSIRT LRRPY FRKME NQDAL VCISE SVPEP IVEWV LCVVK KEEKV LHELF 200 GTDIR CCARN ELGRE CTRLF TIDLN QTPQT TLPQL FLKVG EPLWI RCKAV 250 HVNHG FGLTW ELENK ALEEG NYFEM STYST NRTMI RILFA FVSSV ARNDT 300 GYYTC SSSKH PSQSA LVTIV EKGFI NATED YEIDQ YEEFC FSVRF KAYPQ 350 IRCTW TFSRK SFPCE QKGLD NGYSI SKFCN HKHQP GEYIF HAEND DAQFT 400 KMFTL N。其二级结构如图二所示。此段蛋白质中包含了8个折叠，9个β发卡结构，4个β凸起，30条链，一个螺旋，28个β转角，12个γ转角以及6个二硫键。

(a)