摘 要

目前癌症变成国际最大的公共卫生问题，是每年造成人类死亡的主要原因。目前癌症主要治疗手段是化疗，化疗药物的研究都采用胶束载药，解决了溶解性差、生物利用低等问题。

本次研究实验对象为包载DOX聚（γ-谷氨酸）载药胶束细胞细胞摄取情况，其中分为两部分：一部分为包载DOX聚（γ-谷氨酸）载药胶束的制备，另一部分为细胞对其的摄取情况研究。首先利用大分子的聚谷氨酸制备小分子的聚谷氨酸，以此为基础，制备包载阿霉素（DOX）的聚（γ-谷氨酸）-接枝-聚（L-丙交酯）（γ-PGA-g-PLLA）载药胶束。然后培养正常胎肝细胞L02和人肝癌细胞Bel7402，研究该两种细胞对包载阿霉素（DOX）的聚（γ-谷氨酸）-接枝-聚（L-丙交酯）（γ-PGA-g-PLLA）载药胶束摄取情况。在研究的过程，采用了定性定量的方法，比如：FDNB法、GPC法等。

最后，通过和常用化疗药物载体mPEG-PLGA对比，验证了γ-PGA-g-PLLA载药胶束的增强肝癌细胞摄取效果，有利于DOX在肿瘤部位的富集。证实了该载药胶束的细胞摄取是一个GGT特异性受体介导的细胞内吞过程。

关键词 聚（γ-谷氨酸）；细胞摄取；阿霉素；胶束

Abstract

Cancer has become a major public health problem worldwide and is the main cause of human death every year.Cancer chemotherapy is the main treatment at present, studies of chemotherapy drugs are micelle drug, solved the problem of poor solubility and low creatures use.
The study subjects as package load DOX poly glutamic acid (gamma) drug micelle cells cells to absorb load, which is divided into two parts: the part is the package carrier DOX poly glutamic acid (gamma) for the preparation of micellar, another part of the cells for their intake of research.First use of macromolecule poly glutamic acid poly glutamic acid preparation of small molecules, in turn, on the basis of preparation of package carrier doxorubicin (DOX) of poly (gamma glutamic acid) graft - poly (L - lactide) (gamma - PGA - g - PLLA) drug micelle.L02 and cultivating normal fetal liver cells and liver cancer Bel7402 cell, study of the two kinds of cells for package of doxorubicin (DOX) poly (gamma glutamic acid) graft - poly (L - lactide) (gamma - PGA - g - PLLA) drug micelle intakes.In the process of research, the qualitative quantitative methods, such as: FDNB method, GPC method, etc.
Finally, according to comparison and commonly used chemotherapy drug carrier mPEG - PLGA, verify the gamma - PGA - g - PLLA drug micelle enhancement effect of liver cancer cells to absorb, is advantageous to the DOX concentration in the tumor site.Confirmed the drug micelle cell uptake is a GGT specific receptor mediated cell process.

Key Words poly glutamic acid ; Absorption of Cells;DOX；Micella

目 录

摘 要 I

Abstract II

第1章 绪 论 1

1.1癌症概述 1

1.1.1癌症病因 1

1.1.2癌症治疗 1

1.1.3癌症研究现状 2

1.1.4常用的化疗药物 2

1.2纳米胶束载体 3

1.2.1胶束形态 4

1.2.2胶束的制备 4

1.2.3胶束的稳定性 4

1.2.4胶束的载药 4

1.2.5药物释放动力学模型 4

1.3胶束药物载体基质材料 5

1.3.1聚（γ-谷氨酸） 5

1.3.2 聚丙交酯（PLA） 6

1.4 本课题的主要研究内容 6

第2章 包载DOX聚（γ-谷氨酸）纳米胶束制备及pH敏感性释药研究 7

2.1 引言 7

2.2 实验部分 7

2.2.1材料与仪器 7

2.2.2 低分子量的聚（γ-谷氨酸）的制备及表征 9

2.2.3 氨基封端左旋聚丙交酯（PLLA-NH2）的合成及表征 10

2.2.4 两亲性聚合物γ-PGA-g-PLLA的合成 10

2.2.5 1H-NMR表征 11

2.2.6 胶束的制备及表征 11

2.2.7 胶束的载药及pH敏感性药物释放研究 12

2.3 结果与讨论 12

2.3.1聚（γ-谷氨酸）的微波酸解 12

2.3.2 氨基封端聚丙交酯的合成 14

2.3.3 两亲性聚合物γ-PGA-g-PLLA的合成 16

2.3.4 1H-NMR表征及接枝度的计算 16

2.3.5 胶束的制备及表征 18

2.3.6 胶束pH敏感性药物释放研究 21

第3章 聚（γ-谷氨酸）载药胶束细胞摄取研究 23

3.1 引言 23

3.2 实验部分 23

3.2.1 材料与仪器 23

3.2.2 细胞培养 24

3.2.3 细胞毒性研究 25

3.2.4 载药胶束细胞摄取效果 25

3.2.5 细胞摄取原理研究 26

3.3 结果与讨论 27

3.3.1 材料毒性 27

3.3.2 载药胶束毒性 28

3.3.3 载药胶束细胞摄取效果 28

3.3.4 γ-PGA对细胞摄取的影响 29

3.3.5 GGT酶抑制剂对细胞摄取的影响 30

第四章 总 结 32

4.1结论 32

4.2展望 33

参考文献 34

致 谢 36

第1章 绪 论

1.1 癌症概述

癌症是现代全球面对的较严峻的疾病问题，每年因癌症死亡人数占总死亡人数的10％，所以癌症成为死亡的主要原因。然而，由于环境污染日益严重、医疗不发达、人口老龄化等诸多因素，不发达国家成为癌症的重灾区。以中国为例，在2009年的调查研究表明：2008年，全国新增癌症发病人数100多万人，其中男性占61.5%，女性占38.5%[^[1]]。这异常庞大的数字，使得我们认清到癌症的无情。如何攻克癌症这一难题成为了国际公共卫生的一大难题，为此各国都在做有关研究。

1.1.1 癌症病因

癌症通常由于机体在化学污染、电离辐射、环境污染、微生物及其代谢毒素、遗传特性、内分泌失衡、致癌因素等的作用下导致身体正常细胞发生癌变[^[2]]。癌细胞会无限制地增生，并不断吞噬病人的营养物质，释放出有毒物质，使得病人表现出食欲不振等病状。中国金方医学科学院院长张天正指出：脆弱的免疫力是导致癌症的关键因素[^[3]]。

1.1.2 癌症治疗

目前，癌症治疗方式有以下六种：

1. 中药治疗：中药治疗优势在于缓解症状效果非常明显，常用于辅助其他治疗方法。
2. 手术治疗：是目前比较常用的治疗方法。直接切除肿瘤部位，达到治疗结果，但是此方法受到肿瘤所在位置的限制。
3. 放射治疗：利用高能电磁辐射线（X线治疗和r线治疗）对患者进行治疗，使其生物分子结构发现改变，从而达到癌细胞被破坏的目的。
4. 化学治疗：简称化疗，对患者使用化学物质，实现杀死癌细胞的目的，但其他细胞也会受到威胁。所以是扩散性癌症和晚期癌症的主要治疗手段。
5. 免疫治疗：通过激活免疫系统，诱导特异性免疫细胞出现，促使自身免疫反应，从而增强机体的抗肿瘤能力。
6. 基因治疗：将人源性具有治疗作用的基因或正常基因，以一定的方式导入到人体靶细胞内，直接作用于异常的基因，从而达到治疗癌症的目的。该方法治疗彻底，但价格昂贵。

1.1.3 癌症研究现状

随着医药学的发展，对癌症的研究越来越重视，同时也取得了很大的进步。国外研究现状：麻省理工学院的怀德海研究所Robert Weinberg研究小组发表癌症转移早期相关的研究结果[^[4]]，利用微阵技术来分析老鼠乳癌细胞转移基因表现，发现了Twist转录因子。在胚胎发育的过程中，Twist肩负着引发细胞移动以及组织重组的任务，该情况在肿瘤转移也会出现。美国和日本为首的科研组研究了舞茸[^[5]]，舞茸的成分含有β-（1-6）结合为主链、β-（1-3）结合为侧链的葡萄糖和以β-（1-3）结合为主链、β-（1-6）结合为侧链的葡萄糖，实验证明了这两种葡萄糖可以通过活化免疫功能而显著抑制肿瘤的生长，口服效果也较理想，为癌症患者带了新的希望。目前，诸如美国这些发达国家将肿瘤药物载体的研究重点转为靶向抗肿瘤药物，研究重点在于四大系统：大分子载体系统、整粒载体系统、磁性性药物系统、双重靶向给药系统[^[6]]。如1997年的利妥昔单抗上市，该药物是第一个应用于临床的肿瘤的靶向治疗药物[^[7]]。随着研究的不断深入，抗癌药物不断被发明，为全球癌症患者带来了福音。

而在国内现代癌症研究起点较晚，但我国很早就有关于癌症的记载，华佗在《中藏经》中指出：“夫痈疽疮肿之所作也，皆五脏六腑蓄毒不流则生矣，非独因荣卫壅塞而发者也”。几十年来，国内开始对靶向抗肿瘤药物进行研究，并且取得不错的成果。张庭等人对阿霉素聚合物胶束的制备及其体外特性评价研究，实验表明了LHR聚合物是DOX的优良载体。我国自主研发的分子靶向肿瘤药物——恩度[^[8]]，对肾癌、乳腺癌、食道癌、卵巢癌、胃癌、大肠癌有着不错的疗效，弥补了国内在这方面的空缺，为国内的患者带来了希望。

1.1.4 常用的化疗药物

现代治疗肿瘤史，常用的治疗方法就是化学治疗，以下是化疗药物种类：