摘 要

缺血再灌注损伤（Ischemia Reperfuson,I/R）为临床脑卒中溶栓或手术取栓外后的常见后遗症之一，临床上尚缺乏有效的手段。我们前期的研究提示钠偶联碳酸氢根共转运体（Sodium Bicarbonate cotransporter,NBC）在介导神经细胞应急损伤中具有重要性作用。本文目的在于探讨NBC特异性抑制剂S0859是否通过抑制NBCs的活性，来保护海马神经元免受缺血再灌注损伤，从而验证NBC途径在诱发迟发性神经元中的作用。本研究采用沙土鼠的全脑缺血模型，研究缺血再灌注损伤对沙土鼠空间学习、记忆等神经行为的影响。通过比较沙土鼠假手术组、S0859干预组和缺血再灌注组行为差异以及海马CA1区神经元细胞形态、数目的不同，判断S0859是否能对缺血再灌注引起的迟发性神经元死亡起到保护作用。本研究采用沙土鼠的旷场测试和HE染色，发现S0859可有效保护I/R损伤所致海马CA1神经元迟发性死亡和动物行为异常。该研究提示S0859在临床卒中治疗上具有潜在的应用价值和研究前景。

关键词：缺血再灌注；S0859；NBC；海马CA1区

Abstract

Ischemia reperfusion injury (I/R) is one of the most common sequelae post thrombolysis or subsequent surgical removal of cerebral apoplexy, and there is still lack of effective clinical treatment. Our previous studies suggest that sodium bicarbonate cotransporters (NBCs) play an pivotal role during stress induced injury. The purpose of this study was to assess whether S0859, an NBCs specific inhibitor, could protect hippocampal neurons from ischemia reperfusion injury through inhibiting NBCs activity, and the role of NBC mechanism during hippocampus delayed neuronal death. A gerbil transient global ischemia/reperfusion model was employed to study the effects of ischemia reperfusion injury on animal spatial learning, memory behaviors. By comparing the behavioral differences between the sham operation group,S0859 intervention group and I/R group, as well as the pathophysiological changes in the hippocampus CA1 area，we found that S0859 play a protective role in the delayed neuronal death caused by ischemia reperfusion. In this study, open field test and HE staining were used to find that S0859 could effectively protect the delayed death of hippocampal CA1 neurons and abnormal animal behavior caused by I/R injury. This study suggests that S0859 has potential application value and research prospect in clinical stroke treatment.

Key words: Ischemia reperfusion；S0859；NBC；hippocampal CA1

目录

第一章 绪论 1

1．1 NBC(钠耦连的碳酸氢根离子转运体) 2

1.1.1 NBC的转运过程及其原理 2

1.1.2 NBCs的应用价值 2

1.2 NBCs特异性抑制剂S0859 2

1.2.1 S0859的结构及其原理 2

1.2.2 S0859的临床应用意义 3

1.3 海马CA1 3

1.3.1海马体功能简介 3

1.3.2 海马CA1区功能简介 4

1.4国内外研究现状 4

1.5研究内容及意义 5

1.5.1研究内容 5

1.5.2研究意义 5

第二章 研究方法 7

2.1 试剂及仪器 7

表2.1 实验试剂 7

表2.2 实验仪器 7

2.2神经行为学测试 7

2.2.1沙土鼠全脑缺血再灌注模型的建立 7

2.2.2动物分组 8

2.2.3抑制剂处理 8

2.2.4神经行为学测试 8

2.3海马迟发性神经元损伤的组织形态学染色 8

2.3.1心脏灌流 9

2.3.2大脑切片 9

2.3.3切片染色 9

第三章 研究结果 11

3.1神经行为学测试数据 11

3.1.1沙土鼠运动轨迹 11

3.1.2 沙土鼠运动参数 12

3.2海马迟发性神经元损伤的组织形态学染色 14

3.2.1海马组织HE染色结果 14

3.2.2染色结果讨论 16

第四章 结论 17

参考文献 17

第一章 绪论

  缺血性脑血管疾病是目前临床常见多发病症，致死、致残率极高，发病机制主要为脑血管阻塞导致神经系统供血不足或终断。目前，除了发病早期药物溶栓或手术取栓治疗外，临床上尚缺乏有效的预防措施。然而，相当一部份病人经过治疗血流再通后的一段时间内，反而会出现神经功能障碍以及神经行为异常等更为严重的临床症状，甚至造成更严重不可逆的脑部损伤，该病理过程医学上称之为缺血再灌注损伤（Ischemia Reperfusion，I/R），在病理生理上表现为相应神经元的迟发性死亡及突触功能障碍。脑缺血再灌注损伤引起神经元细胞的死亡主要包括细胞凋亡、自噬两种方式，其中凋亡最常见 [^[1]]。缺血再灌注损伤的机制尚不十分清楚，酸中毒，谷氨酸兴奋性中毒毒性（大量实验发现，脑组织在严重缺血后，兴奋性氨基酸大量释放所产生的兴奋性毒性作用在缺血导致的神经元损伤中发挥着重要作用），氧自由基释放，氧化应激反应等多种因素参与缺血再灌注细胞损伤过程，同时，还涉及细胞信号转导的异常，炎症反应的激活，蛋白激酶的激活，体液因子、细胞因子、补体的参与以及细胞间和血小板异常的相互作用。近年来，随着对缺血性再灌注损伤的分子生物学机制的深入研究，发现突触的可塑性损伤以及突触活动的消失是脑缺血后最先出现的病理过程，因此调节突触的可塑性是促进脑卒中后神经功能恢复的重要机制之一[^[2]]。

海马结构是学习和记忆的控制中心，其海马CA1区域的锥体神经元对缺血再灌注损伤非常敏感，多于缺血再灌注2～4天后发生迟发性神经元死亡（Delayed Neuronal Death，DND），其中凋亡和自噬等过程在I/R损伤中发挥重要作用[^[3]]。缺血再灌注损伤引发迟发性神经元死亡可能同兴奋性氨基酸过度释放、钙内流超载及活性氧自由基代谢紊乱等多种机制有关，其中“钙稳态”失衡是缺血再灌注损伤的病理过程中的重要环节，是进一步激活相关蛋白激酶或水解酶及造成神经细胞损伤的关键[^[4]]。非突触NMDA受体、IP3受体及某些钙通道参与了缺血再灌注损伤的早期“钙超载”过程，阻断相应途径可不同程度地预防脑缺血再灌注损伤所引发的迟发性神经元损伤。近期多项研究却未能证实上述钙通道阻断剂的临床应用价值，所以可能有其它尚未确定的机制参与缺血再灌注损伤及“钙稳态”失衡过程，因而有必要从新的角度全面思考和探讨缺血再灌注损伤的病理机制，为脑血管疾病的预防和治疗找寻新方法。