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海藻酸钠体外抑制胃蛋白酶活性

和差向异构化的效果

摘要

海藻酸钠作为一种通用的生物聚合物而广泛用于食品、纺织和制药等行业。其中一个主要用途是用于治疗反流性疾病，在这篇论文里我们调查海藻酸钠是否可以影响胃蛋白酶活性，其中，胃蛋白酶的活性被认为是反流病的一个主要的因素。海藻酸钠的主要糖醛酸结构可以使用差向异构酶技术进行改变，我们可以通过测试特制的海藻酸钠，来确定海藻酸钠作为胃蛋白酶抑制剂的最佳结构。目前已有关于使用显色肽的体外N-末端测定和酶动力学研究在海藻酸钠存在下的胃蛋白酶活性的研究，所述数据清楚地表明，海藻酸钠能够在体外以非竞争性方式浓度依赖性地降低胃蛋白酶的活性。这种活性在具有宽范围的结构和大小的不同海藻酸钠之间是可变的，并且与甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的交替序列正相关。我们推测海藻酸钠可能通过抑制胃蛋白酶（一种反流的有害成分）在治疗反流病中发挥更广泛的作用。

缩写：M，甘露糖醛酸; G，古洛糖醛酸;GERD，胃食管反流病;1H NMR，核磁共振;F，摩尔分数; SEC-MALLS，尺寸排阻色谱-多角度激光散射（SEC-MALLS）;TNBS，三硝基苯磺酸;[S]，底物浓度;V，初始反应速度;Vmax，最大酶速度;Km，Michaelis-Menton常数; r，皮尔森的相关系数。

1. 介绍

海藻酸钠是一种多糖，是褐藻（褐藻纲）中的主要结构组分，比如北方海带、淡黑巨海藻和岩衣藻。 海藻酸钠也由一些细菌如铜绿假单胞菌和棕色固氮菌产生并作为它们的胞外多糖。海藻酸钠是（1→4）键连接的beta;-D-甘露糖醛酸（M）和其C-5差向异构体alpha;-L-古洛糖醛酸（G）的线性共聚物。 M和G残基可存在于同聚区（M区或G区）或杂多聚区（MG区）（Smidsrod和Draget，1996）。

海藻酸钠是食品，纺织和制药行业中用途最广泛的生物聚合物之一（Onsoyen，1996）。它们起增稠剂，稳定剂，凝胶形成剂和成膜剂的作用。在制药工业中，应用于包括控释介质，印模材料，伤口敷料，抗反流药物（Onsoyen，1996）和微胶囊化（Skjak-Braek和Espevik，1996）。海藻酸钠的多种应用与其结构的功能有关，因为不同的M和G序列可以表现出不同的物理和化学性质（Smidsrod和Draget，1996年）。

现在可以通过控制海藻酸钠的一级结构，从而控制它的物理和化学性质。人们目前已经可以很好理解如何通过基因和酶控制由铜绿假单胞菌和棕色固氮菌产生的海藻酸钠结构的过程。细菌最初合成仅由M残基（聚甘露糖醛酸）组成的海藻酸钠，并将其分泌到细胞外空间。从这一点来看，聚合物链内M向G的转化是由甘露聚糖C-5差向异构酶催化的（May和Chakrabaty，1994）。目前已有研究将编码甘露糖醛酸C-5差向异构酶的基因从铜绿假单胞菌和棕色固氮菌中分离，并命名为AlgE1-AlgE7，且各自的酶具有不同活性模式（Ertesvag等，1994; Svanem等，1999年）。然后它们可用于在体外修饰海藻酸钠（来自于海藻或细菌）的序列（Ertesvag等，1994; Ertesvag等，1995）。这使得海藻酸钠的性质能够被控制并适合于特定的商业应用。

已经证明海藻酸钠具有几种生物活性。某些海藻酸钠，特别是那些具有高M含量的海藻酸钠，具有免疫刺激作用，例如细胞因子诱导（Flo等，2000; Jahr等，1997）和针对致病性入侵的保护（Skjak-Braek和Espevik，1996）。海藻酸钠表现出对食管组织的生物粘附能力（Batchelor等，2002; Richardson等，2004,2005）并且可以与粘蛋白正相互作用（Batchelor等，2000; Taylor等，2005）。在作为会议摘要的初步研究中，海海藻酸钠已被证明可以上调细胞迁移过程，因此有可能加速伤口的修复（Dunne等，2002），保护大鼠胃粘膜免受压力和吲哚美辛诱导的溃疡。（Del Buono等，2001）。在海藻酸钠存在下，液相内吞作用的过程也被上调（McPherson等，2002），它们具有降低胃蛋白酶活性的能力（Sunderland等，2000），并具有细胞内分子效应（ Johnston等，2002; Dettmar等，2004）。

海藻酸钠的许多生物活性特性与胃食管反流病（GERD）的治疗或预防有关。胃食管反流病是一种胃内容物向食道的逆行运动而导致胃灼热的症状。胃蛋白酶是胃反流中的主要侵袭因子，并且是在GERD患者中观察到的大部分食道损伤的原因（Salo等，1983; Tobey等，2001）。含有海藻酸钠的产品目前用于治疗GERD（例如Gaviscon Advancereg;），尽管目前主要作为预防反流的物理屏障，但是很明显海藻酸钠可以在治疗GERD中发挥出更大的作用。 因此为了从长远角度看待药物的开发，我们利用差向异构酶技术设计新的海藻酸钠并评估它们抑制胃蛋白酶活性的能力，并确定体外最佳活性所需的海藻酸钠结构。

1. 材料和方法
   1. 海藻酸钠

目前市售的海藻海藻酸钠由FMC Biopolymer，Drammen，Nor-way提供。用于甘露糖醛酸C-5差向异构体AlgE1，AlgE4和AlgE6处理的新海藻酸钠由挪威特隆赫姆的Gudmund Skja˚k-Braelig;k, NOBIPOL提供。通过1H-NMR表征海藻酸钠以分辨单体，二联体和三联体频率（Fx）（Smidsrod和Draget，1996），通过特性粘度和尺寸排阻色谱-多角度激光散射（SEC-MALLS）确定分子量。 表1显示了本研究中使用的39种不同的海藻酸钠。通过在使用顶置式搅拌器搅拌的去离子水中添加海藻酸钠粉末来制备海藻酸钠溶液。

• 1. 其他材料

猪胃蛋白酶A EC.3.4.23.1（2870单位/ mg）胃蛋白酶抑制剂A获自Sigma-Aldrich。三硝基苯磺酸（TNBS）得自Fluka。所有其他试剂均来自Fisher Scientific UK，并且是分析纯级。

• 1. N-末端测定

使用N-末端测定法（Hutton等，1986）测定蛋白水解活性，该方法是一种灵敏的比色法，用于检测来自消化的蛋白质底物的新形成的N-末端。该测定在pH 2.2下进行，其中胃蛋白酶处于最佳活性而没有自身消化的风险，就像在较低pH下发生的那样，并且蛋白质底物在该PH下是可溶的。将猪胃蛋白酶在pH 2.2的0.01M HCl中稀释至浓度为20micro;g/ml，产生的标准曲线为0micro;g至2micro;g胃蛋白酶（总体积200micro;l）。至于测试溶液，则是将100micro;l l5mg/ml海藻酸钠水溶液加入100micro;l胃蛋白酶标准品中。将pH值为2.2的0.01M HCl中的500微升10mg/ml琥珀酰白蛋白底物加入酶溶液中，并在37℃下反应30分钟。加入500micro;l 4％NaHCO3终止反应。用500micro;l 10mM三硝基苯磺酸（TNBS）显色，并在50℃下反应10分钟。加入500micro;l 10％十二烷基硫酸钠和250micro;l 1M HCl后，在340nm下针对空白试剂测定吸光度。根据标准曲线确定胃蛋白酶活性的平均抑制百分比。

该测定在0micro;g和3micro;g猪胃蛋白酶之间是线性的。该测定的检测限为0.05mu;g猪胃蛋白酶，其相当于1micro;g胃蛋白酶的95％抑制和2micro;g胃蛋白酶的97.5％抑制。测试范围内的变异系数为4％。

排除0.01M HCl的影响，加入的海藻酸钠水溶液不会显著影响反应的pH。在海藻酸钠存在下，PH为2.3，与胃蛋白酶标准曲线的平均pH为2.2相比，这个差异对胃蛋白酶活性几乎没有影响。

• 1. 粘性

为了提供本研究中使用的海藻酸钠的额外表征，使用旋转流变仪（Bohlin CVO）控制的应力流变仪（Bohlin，Cirencester，Gloucestershire，UK）测量海藻酸钠溶液的粘度，设备具有小样品适配器杯并具有间隙尺寸为7mm的凸台几何形状。在25℃下获得平衡流动曲线，施加的剪切应力从1Pa逐步增加到100Pa。

• 1. 动力学测定

使用已建立的Dunn方法（Dunn等，1984）测定胃蛋白酶活性的酶动力学。 将生色七肽（Lys-Pro-Ile-Glu Phe-Nph-Arg-Leu）溶解于pH3的0.1M甲酸钠缓冲液（底物浓度[S] 0-110nM）中。反应在37℃下进行，且反应超过一分钟后使用1cm光程的石英比色皿在300nm下测量吸光度。向800micro;l底物中加入25micro;l猪胃蛋白酶在0.1M甲酸钠缓冲液（终浓度17.1nM），然后分别加入①25micro;l单独缓冲液 ②胃蛋白酶抑制剂A在0.1M甲酸钠缓冲液中（终浓度8.1nM，20.2nM，100.9nM）③海藻酸钠在水中（终浓度3.8micro;M和7.3micro;M）。 绘制底物浓度[S]对初始反应速度（V）的关系曲线，并通过应用Michaelis-Menton非线性回归确定Vmax和Km。 绘制Lineweaver-Burke图（1/[S]对1/V）以显现抑制参数。

• 1. 统计分析

数据表示为平均值（标准偏差）。Pearson相关系数（r）用于确定抑制和海藻酸钠特征之间的关系。如果plt;0.05，则认为数据是显著的。

1. 结果
   1. 浓度 - 反应效应

测试了8种海藻酸钠在不同浓度下抑制胃蛋白酶活性的能力。选择的这些海藻酸钠分别代表来自于细菌或海藻，具有不同的一级结构和分子量。初始海藻酸钠浓度（w/v）在去离子水中为5mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，200micro;g/ml，20micro;g/ml和2micro;g/ml。海藻酸钠重量的比值的范围为：从海藻酸钠过量500倍到胃蛋白酶过量10倍。图1显示了不同海藻酸钠的浓度-反应曲线。尽管幅度不同，但所有海藻酸钠均观察到对猪胃蛋白酶的浓度依赖性抑制现象。即使在最低的海藻酸钠浓度下，也观察到对胃蛋白酶活性的抑制（5-20％），并且抑制活性都以浓度依赖性的方式增加。浓度在5mg/ml和2mg/ml的海藻酸钠之间有显著的差异，但在较低浓度下差异并不明显。经决定，将5mg/ml海藻酸钠用于进一步的实验以区分不同海藻酸钠的抑制活性。

• 1. 多种海藻酸钠的比较

在以海藻酸钠的浓度为5mg/ml（w/v）的条件下测试了39种不同海藻酸钠的选择对抑制猪胃蛋白酶活性的影响。这些不同的海藻酸钠来自于各种海藻和细菌，有一些经过了差向异构化以改变它们的一级结构， 结构可以通过1H NMR确定（表1）。对于1micro;g胃蛋白酶（n=34海藻酸钠），测试的不同海藻酸钠的平均胃蛋白酶抑制范围为39％至81％，对于2micro;g胃蛋白酶（n = 36海藻酸钠）为38-75％（表2）。有两个海藻酸钠池，一个是仅产生约40％抑制的小子集和一个产生更大但更多变的胃蛋白酶活性抑制的更大子集。在所有实验中，胃蛋白酶抑制剂A完全消除了胃蛋白酶活性。

• 1. 关联

对于每种海藻酸钠，主要结构信息由1H NMR提供。分子量由特性粘度计算或使用尺寸排阻色谱-多角度激光散射（SEC-MALLS）测量。另外，在0.4Pa施加的剪切应力下测量浓度为5mg/ml的每种海藻酸钠的实际粘度（表2）。然后将这些独立变量与2micro;g胃蛋白酶对胃蛋白酶活性的抑制百分比相关联。表3显示了每个变量的Pearson相关系数（r）以及关系的显著性。在与海藻酸钠分子的大小相关的变量（分子量，特性粘度或0.4Pa下的粘度）之间未观察到相关性。海藻酸钠的G（古洛糖醛酸）含量与胃蛋白酶抑制活性之间存在显着的负相关关系。那些藻酸具有高F_G, F_GG, F_GGG并且N_Ggt;1的海钠，表明海藻酸钠分子中存在的大区域的G嵌段对胃蛋白酶活性的抑制能力较差。相反，F_M和胃蛋白酶抑制之间存在正相关的关系，尽管M的长序列与抑制能力没有关联，但交替单体的序列(F_GM/MG, F_MGM)确实显示出，交替结构的比例增加与胃蛋白酶抑制能力的提高呈正相关。

• 1. 酶动力学

胃蛋白酶消化显色肽显示Michaelis-Menten动力学随着底物浓度[S]增加而达到饱和。增加胃蛋白酶抑制剂A的浓度，V-[S]曲线向下移动（图3）。 对Lineweaver-Burk图的分析显示x-截距（1/Km）保持恒定，表明胃蛋白酶抑制剂A的作用为非竞争性抑制.

先前显示在其他测定中具有生物活性的代表性海藻酸钠样品（AG）随着海藻酸钠浓度的增加，V-[S]曲线也向下移动（图4）。对Lineweaver-Burk图的分析显示x-截距（1/Km）保持恒定，表明海藻酸钠同胃蛋白酶抑制剂A的作用一样也是非竞争性抑制。

1. 讨论

这里描述的数据清楚地表明海藻酸钠能够在体外降低胃蛋白酶的活性。这种活性在具有宽广范围的结构和大小的不同海藻酸钠之间是可变的。本研究未完全消除胃蛋白酶活性。通过初始浓度为5mg/ml的海藻酸钠G（表1），且海藻酸钠是胃蛋白酶重量的500倍时观察到的最大平均抑制率为88.5％。该海藻酸钠是通过用AlgE4完成细菌甘露聚糖的差向异构化而产生的大分子量聚交替海藻酸钠。海藻酸钠能够以浓度依赖性方式抑制胃蛋白酶活性，并且即使当胃蛋白酶的重量超过海藻酸钠时，仍然可以观察到抑制现象。

从该数据可以清楚地看出

资料编号：[4195]