引入

卵巢癌是美国最致命的妇科恶性肿瘤，也是第二常见的妇科恶性肿瘤，几乎占所有妇科癌症死亡人数的一半。“大多数晚期卵巢癌患者都是通过手术、静脉注射紫杉醇和铂类药物apy来治疗的。2化疗耐药发生率高，限制了化疗的效果。因此，需要新的治疗策略来提高传统细胞毒性化疗的疗效和过度。虽然多中心,随机III期临床试验表明,腹腔内化疗(IP)优于标准静脉化疗患者体积小、剩余,先进的卵巢癌上皮,“6和IP化疗对晚期卵巢癌提高整体和无病生存期,”有几个障碍实现这种治疗的临床实践,包括毒性问题和缺乏腹膜输液设备g-to的技厚朴的根和茎皮历来被中国人用来治疗血栓性中风、胃肠不适、焦虑和神经紊乱。厚朴酚(HK)是木兰皮中主要的酚类成分之一。近年来，本品被发现具有药理作用，HK具有抗氧化、抗溶栓、抗菌、抑制黄嘌呤氧化酶活性及抗焦虑作用。结果表明，HK具有显著的抗肿瘤作用。

既往报道证实其对人结肠癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、黑色素瘤细胞是胰腺癌细胞、肝癌细胞、白血病细胞、肺癌和卵巢癌的活性，其中诱导凋亡可能参与其中。但由于HK的水溶性较差，大多数研究都将其溶解在二甲基亚砜(DMSO)中进行研究，这使得它的临床应用受到很大限制。为开发HK的水性配方，本实验室采用乳液溶剂蒸发法制备了HK- NPs。

作为一种用于IP化疗的药物控制传递系统(DDS)，生物降解聚乙二醇-己内酯-聚乙二醇(PEG-PCL-PEG, PECE)热敏水凝胶在早期工作中就得到了合成。PECE水凝胶是一种在室温下自由流动的溶胶，在体温下变为不流动的凝胶，作为药物的原位贮存库。热敏PECE水凝胶是一种可注射的DDS，而不是腹腔输注装置。本研究旨在确定HK-NPs可以抑制卵巢癌SKOV3细胞在体内外的生长和用于 IP化疗的、作为体内一种新颖的控制剂型—聚合物基体HK-NPs水凝胶可以延长小鼠的生存轴承卵巢癌腹膜癌扩散(OPC)和显示更明显的抗肿瘤效应。

材料和方法

2.1 材料、细胞系和动物

Pluronic1 F127 (Sigma, USA)，聚(乙二醇)甲醚(MPEG, Aldrich, USA)， e-己内酰胺(e-CL, Aldrich, USA)，六亚甲基二异氰酸酯(HMDI， Aldrich，USA)，锡辛酸盐(Sn(Oct) 2, Sigma，USA)，碘化丙钠(PI, Sigma，USA)，RNase A (Sigma，美国)，DMSO (Sigma，美国)，3-(4,5-二甲基-2-噻唑啉)- 2,5 -二苯基-2- h -四唑溴化铵(甲基噻唑啉四唑，MTT, Sigma，USA)，罗斯威尔公园纪念1640培养基研究所(RPMI 1640, Gibico, USA)， L -谷氨酰胺

(Gibico，USA)，胎牛血清(FBS, Gibico，USA)，阿米卡星(TaKaRa，USA)，胰蛋白酶(Invitrogen，美国)和原位细胞死亡使用检测试剂盒(瑞士罗氏公司)作为接收器。主要抗体为小鼠抗cd34 II类(Gene Tech)和小鼠抗增殖细胞核抗原(PCNA)克隆pc10 (Invitrogen)。用于比色免疫组化分析的次级抗体是生物素化山羊抗大鼠免疫球蛋白和山羊抗小鼠IgG (BD生物科学解毒)。底物缓冲液为3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)底物试剂盒。所用试剂均为分析试剂。人类卵巢癌细胞系SKOV3,源自apapillary人类卵巢浆液性囊腺癌,从美国类型文化集合(写明ATCC,罗克维尔市,马里兰州)购买以及在RPMI 10%的边后卫、2毫米L谷氨酰胺、0.1毫克毫升21阿米卡星、37 ℃和湿润的5%的CO 2中培养。雌性athymic裸鼠(BALB/c)， 6-8周龄，购自北京维力河实验动物科技有限公司。小鼠被置于实验动物中心、四川大学生物治疗与癌症中心国家重点实验室特定的无菌环境中，按照现行指导方针进行饲养。所有的研究都得到了四川大学动物保护和使用委员会的批准和监督。

2.2和厚朴酚纳米粒子的制备与表征（HK-NPs）

本实验采用乳液溶剂蒸发法制备了HK-NPs。简言之，将HK结晶(中国成都四科花生物科技有限公司)溶于乙酸乙酯中，诱导成多元F127水溶液。过度搅拌使这种混合物形成水包油乳液。过度搅拌使这种混合物形成水包油乳液。当乙酸乙酯在旋转蒸发器中蒸发，得到了HK-NPs。纳米粒载药量(DL)和包封率(EE) 测定如下：将10 mg冻干HK-NPs溶于0.1 mL乙腈中，采用高效液相色谱法测定了溶液中HK的含量。根据公式(1)和(2)计算HK-NPs的DL和EE:

载药量＝times;100％ （1）

包封率＝times;100％ （2）

制备的HK-NPs经平衡10 min后，用Malvern纳米zs90激光粒度分析仪进行粒度测定。所有结果均为三次测试运行的平均值，所有数据均表示为平均值plusmn;“标准差(SD)”。用透射电镜(TEM,H-6009IV，日立，日本)观察了HK-NPs的形态特征。将HK-NPs用蒸馏水稀释，置于覆有硝基纤维素的铜格栅上。用磷钨酸对样品进行负染色，室温干燥。

2.3水凝胶及载HK-NPs水凝胶的分布及表征(HK-NPs/水凝胶)

本实验室采用早期描述的开环聚合的方法合成了可生物降解的PECE三嵌段共聚物。采用傅立叶变换红外光谱(FTIR, NICOLET 200SXV, NICOLET,USA)、1h核磁共振光谱(1h - nmr, Varian 400光谱仪，Varian, USA)和凝胶渗透色谱(GPC, Agilent 110 HPLC,USA)对得到的PECE共聚物进行了表征测定。为制备HK-NPs/水凝胶，将PECE共聚物在一定温度下溶于水中，冷却至4℃，形成可注射可降解的热敏水凝胶。然后将所得的HK-NPs与PECE水凝胶混合形成HK-NPs/水凝胶复合材料，将PECE共聚物的浓度保持在30% wt。用4毫升螺旋盖紧的试管，瓶身内径10毫米，采用试管倒置法研究了热敏PECE水凝胶和HK NPs/水凝胶的溶胶-凝胶-溶胶相变行为。通过倒置小瓶观察溶胶-凝胶-溶胶的转变，凝胶和溶胶的条件分别定义为一分钟内“无流动”和“流动”。无论胶束含量如何，含不同含量HK-NPs的水凝胶样品的体积均保持在1ml。将水凝胶样品以每分钟1℃的升温速率缓慢加热，从4℃加热到发生降温时水的温度。采用改良透析法研究了HK- nps或HK- nps /水凝胶对HK的体外释放行为。将HK- NPs或HK- NPs水凝胶(30 wt%)置于透析管中(分子质量截止为3.5 kDa)，以DMSO中HK溶液(1mg /mL )作为对照。将透析管置于含吐温80 (0.5% wt)的PBS 10ml(预温至37 ℃, pH =7.4)中，37 ℃轻轻摇匀(100 rpm)。在预定的时间用预加热的新鲜PBS代替培养基,离心后，取出释放介质上清液，保存在-20℃至分析。采用高效液相色谱法对释放的药物进行定量。所有结果均为三次测试运行的平均值，所有数据均表示为平均值。

将HK试样稀释后，再用高效液相色谱法测定其浓度。溶剂输送系统配有柱式加热器和加装自动进样器。使用Waters 2996检测器进行检测，色谱分离在反相c18柱上进行(4.6 times; 150 mm-5 um, Sunfire分析柱)。柱温保持在28℃ 。以乙腈/水(60/40,v/v)为洗脱剂 流速为1ml min-1 。

2.4 体外细胞增殖实验

采用标准MTT法对HK- nps和游离HK的活性进行了比色分析。并对Pluronic1 F127与PECE共聚物的体外细胞毒性进行了研究。用指定浓度的HK- nps、游离HK、Pluronic1 F127和PECE共聚物分别处理96孔板培养的SKOV3细胞24 h和48 h。以未使用试剂处理的细胞作为阴性对照。在酶标仪(MicroplateReader 3550-UV, BIO-RAD)上定量570 nm波长下的光密度(OD)。从6个独立实验数据中计算细胞存活率相对于未处理细胞的平均百分比，所有数据均表示为均值plusmn;标准差。

2.5 DNA碎片分析

如前所述，用琼脂糖凝胶电泳分析DNA的裂解和断裂。SKOV3细胞用12.5 ug/mL 21或20 ug mL-1 的HK-NPs处理36h，收集细胞, 用PBS洗涤，在200 mL裂解缓冲液(50 mM Tris-HCl pH = 8,20 mM EDTA, 0.25% Nonidet P-40)裂解，加入RNase A，最终浓度为200 mg mL-1，在37 ℃下水浴90分钟。将蛋白酶K添加到初始浓度为300 mg mL -1的培养基中，在水浴中培养90 min，用4ml缓冲液稀释15ml DNA样品、1.5%琼脂糖凝胶电泳凋亡DNA阶梯(Invitrogen) (50v, 2h)。用0.1 mg mL -1溴化乙锭对凝胶进行染色观察，使用凝胶成像系统(凝胶Doc 1000, BIO-RAD amp; Video Copy Processor，三菱)。

2.6 碘化丙钠(PI) DNA染色

采用PI染色染色体DNA形态学检测，证实HK-NPs的凋亡作用。在6孔板中孵育skov3细胞加入12.5 mg mL HK-NPs、Pluronic1 F127和PECE共聚物，在2ml RPMI-1640中孵育48 h。对照组为未加试剂处理的RPMI-1640 2ml。去除化合物后，用PBS冲洗细胞，室温下用预冷70%乙醇固定30 min, PBS冲洗细胞两次，用0.5 mL PI (5 ug/mL PBS)染色10 min。根据荧光显微镜(TE2000-U，尼康)，在激发波长535nm /发射波长615nm处观察到染色质荧光。凋亡细胞表现为胞质和细胞核收缩及染色质凝结。

2.7 流式细胞术分析

为了进一步证实HK-NPs的凋亡作用，进行了流式细胞术检测。SKOV3细胞在6孔板中用12.5 mg mL-1的HK-NPs 、PluronicF127和PECE共聚物在2ml RPMI-1640中处理48h 。2 mL添加未经处理的RPMI-1640作为对照组。收集细胞，用PBS 清洗、预冷70%乙醇固定30分钟

20 uL 核糖核酸酶 (250 mg mL ^-1)染色，最后用200 mL PI染色（50 mg mL 21)，静置30 min。流式细胞仪(EPICS Elite ESP, Beckman Coulter，美国)来分析细胞凋亡。

2.8 小鼠体内模型及治疗方案

在治疗HK-NPs前，以裸鼠为实验对象，以腹腔注射为基础，测定HK-NPs的最大耐受剂量(MTD)。结果表明，在不同剂量时，HK-NPs的MTD为200 mg Kg ^-1，超过30mg Kg ^-1时，老鼠表现出不舒服的迹象。因此，选择10 mg Kg ^-1作为体内抗肿瘤药物实验。建立小鼠体内

OPC模型，原木生长阶段收获32个SKOV3细胞，并以一定浓度皮下注射到5只裸鼠的背部细胞，用0.1 mL不含血清的RPMI-1640注射。六个星期以后，当肿瘤直径达到小鼠背部约1-1.5 cm时，处死5只小鼠。肿瘤是通过切除坏死组织而获得的结缔组织，然后被切碎成1毫米3小颗粒，这种大小可以顺利地使用14号针绘制。加入12ml无血清的rmi -1640。40只小鼠腹腔注射0.3 mL肿瘤悬液，每次注射前均进行剧烈振动。腹腔肿瘤悬液注射后7天，随机分为6个治疗组(每组10例，5例用于肿瘤生长抑制研究，5例用于生存期研究)。每周腹腔注射200ul生理盐水(NS)、注射200ml PECE水凝胶(NPs/水凝胶)中的空白纳米颗粒、注射200ml 活性 HK(含HK 10mg kg^-1) ，静脉200毫升HK-NPs (含 HK10mg kg^-1)注射一次,200毫升HK-NPs(含 HK10mg kg^-1),和200毫升HK-NPs /水凝胶(含HK 10mg kg-1)是腹腔内注射。

在肿瘤生长抑制研究中，每天监测小鼠(每组5只)的一般健康状况，每3天称一次体重并且在第31天的时候杀死它们。记录肿瘤分布及肿瘤重量。组织标本固定于福尔马林中进行石蜡包埋。免疫组化分析。为了进一步研究卵巢癌的治疗效果，观察各组小鼠存活时间(每组5只)，用HK-NPs和HK-NPs/水凝胶处理小鼠，观察其潜在毒性。观察它们的皮毛、食欲、地位和行为。将心、肺、肝、脾、肾、肠组织固定于10%缓冲福尔马林溶液中，石蜡包埋。切片用苏木精和伊红(Hamp;E)染色并在光学显微镜下观察。

2.9 凋亡肿瘤细胞检测

末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP镍端标记(TUNEL)染色是根据制造商的说明(Roche)使用原位细胞死亡检测试剂盒进行的。代表性组织切片采用OLYMPUS BX600显微镜和SPOT FIEX相机拍摄。tunel阳性细胞计数为10例，在6400倍放大下随机观察2场。

2.10 免疫组化检测CD34和PCNA

石蜡包埋肿瘤组织切片，采用链霉亲和素-生物素标记法定量检测微血管密度(MVD)和pcna。第一抗体为大鼠抗小鼠CD34 (Gene Tech)和第二抗体生物素化山羊抗大鼠免疫球蛋白(BD生物科学解毒)肿瘤组织和微血管的图像由OLYMPUS BX600显微镜和spot FIEX相机拍摄。单个微血管被定义为CD34染色阳性的离散簇状或单个细胞，作为微血管评分需要腔的存在。为了量化MVD，在6100倍放大下，研究了10个随机的0.159 mm 2个场，

英语原文共 13 页

资料编号：[3695]