眼内给药靶向塞来昔布载聚原酸酯纳米粒的合成、表征及体外研究

Mallika Palamoor a,1, Monica M. Jablonski a,b,lowast;

关键词：聚原酸酯、塞来昔布、纳米粒子、溶剂扩散、尼罗红、细胞毒性

摘要：本研究旨在改善水溶性差的药物塞来昔布的眼部生物利用度，为治疗慢性眼病提供新的选择，例如与年龄相关的斑块性变性和糖尿病性视网膜病变。为此，我们开发了一种新型药物负载聚（原酸酯）纳米粒子（NPs）配方。我们在大小，形态，控制释放，降解和细胞相容性方面对NP进行了表征。使用泊洛沙姆188作为稳定剂的双乳液溶剂扩散法制备稳定且透明的NP乳液。物理特性显示出151-164nm的窄范围尺寸分布，具有球形形态，负zeta电位和非常高的塞来昔布包封效率（98％）和负载（64％）的聚（原酸酯）NP。药物释放遵循由表面侵蚀控制机制的零级释放，具有任何爆发效应。通过测量初始降解产物如乳酸的浓度来观察聚（原酸酯）NP的降解。 MTT研究显示NPs（高达1 mg / ml）对HEK 293细胞的毒性极小。聚（原酸酯）NPs未被Muuml;ller或HEK 293细胞内化，这对于药物载体将药物长时间递送至眼睛后部是非常需要的。这些特征有可能减少治疗慢性眼病所需的眼内注射次数。copy; 2013 Elsevier 公司保留所有权利

1. 简介

年龄相关性黄斑变性（AMD）和糖尿病性视网膜病变（DR）共同构成老年人群失明的主要原因^[1]。对于治疗这些疾病，需要更安全和更有效的治疗方法。AMD（湿型）和DR都有一些与其病理生理学进展有关的共同因素;这些因素包括血管内皮生长因子（VEGF）等生长因子的参与^[2,3]，新生血管形成和细胞增殖^[4]。具有抗炎，抗增殖或抗VEGF活性的药物可有益于治疗上述疾病。塞来昔布具有所有这些所需的特性，因为它具有抗炎，抗增殖作用，并且在视网膜中具有抗VEGF作用^[5]。该药物是一种选择性环氧合酶-2（Cox-2）抑制剂，可以减少视网膜色素上皮细胞中VEGF的分泌，从而对视网膜脉管系统和脉络膜的内皮细胞具有抗增殖作用。塞来昔布的抗增殖作用通过Cox-2非依赖性机制表现出来，因此并非所有Cox-2抑制剂都可用于治疗这些疾病。因此，抗增殖和抗VEGF作用共同使塞来昔布成为治疗AMD和DR的独特候选药物^[5,6]。

治疗视网膜疾病的障碍是将药物有效递送至视网膜。局部途径是无效的，因为局部应用的药物不会到达眼后段，并且全身途径与毒性相关，因为在视网膜中达到治疗水平所需的高剂量^[7]。替代途径，例如玻璃体内和眼周途径，可以为视网膜提供更高的局部治疗水平^[8]。与眼周途径相比，玻璃体内途径可以在视网膜上提供显着有效的药物浓度。然而，当玻璃体内单独注射小药物分子时，它们迅速从玻璃体中清除，因此需要频繁注射以维持治疗水平。频繁的玻璃体内注射可能导致并发症，如视网膜脱离，眼内炎和白内障^[9]。 AMD和DR都需要长期治疗，因为它们是慢性疾病。使用可生物降解的，无毒的和长期持续的药物递送系统对于治疗这些视网膜的慢性病症是必不可少的。将玻璃体内途径与药物递送系统偶联可以在视网膜中提供有效的塞来昔布水平以延长时间并且还最小化频繁注射的必要性^[10,11]。

塞来昔布在pH 7和40℃时的水溶解度为3-7mu;g/ ml。塞来昔布口服静脉注射后的绝对生物利用度为22-40％^[12]。它是一种亲脂性化合物（logP = 3.5）[13]并且已经被证明属于生物制药分类系统的2级分部，其包括难溶性和高渗透性药物^[13]。通常认为，通过生物膜具有低溶解度和高渗透性的化合物将显示体内溶出速率限制的吸收。因此，预期改善这种药物的溶解度可提高生物利用度，从而提高治疗效力。众所周知，通过将药物粒径减小到纳米范围，可以显着改善用于口服递送的水溶性差的药物的生物利用度^[14]。除了更高的溶出速率和饱和溶解度^[15-17]之外，据报道，与颗粒药物相比，NPs由于其大的表面积而表现出更高的生物粘附性。到目前为止，塞来昔布已被加载到脂质体^[18]，自微乳化药物传递系统^[19]，微粒^[20]和纳米乳剂^[21,22]，用于各种生物医学应用。

在本研究中，我们首次报道了新型塞来昔布负载聚（原酸酯）NP的合成，其物理表征和细胞相容性研究。聚（原酸酯）是疏水的，生物相容的^[23,24]和可生物侵蚀的^[25-27]聚合物，具有优异的特性。来自聚（原酸酯）的药物释放动力学以及聚合物降解速率遵循零级动力学而没有任何爆发效应^[28]。此外，药物释放可以通过诸如聚合物分子量和掺入的活性物质的物理化学性质等因素来控制^[29-31]。本研究的主要目的是开发可生物降解的，无毒的聚（原酸酯）NPs。并评估他们提供持续塞来昔布以治疗有效浓度至少三个月的能力。

1. 材料和方法
   1. 材料

1,1-癸二醇，d，l-内酯，泊洛沙姆188,3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT），乙酸乙酯和二甲基亚砜及荧光染料，尼罗红 得自Sigma-Aldrich（St.Louis，MO）。 3,9-二乙基-2,4,8,10-四氧杂螺[5.5]十一烷从美国AKScientific公司获得。 乳酸测定试剂盒购自BioVision（Milpitas，CA）。 使用所得的乙酸乙酯和二甲基亚砜（DMSO）。 Dulbecco#39;s 改良鹰状培养基，购自Fisher Scientific（Fair Lawn，NJ）。 Oregon Green 488 DHPE和To-Pro-3碘化物购自Invitrogen（Grand Island，NY）。 人胚胎肾细胞系（HEK 293），Eagle的最小必需培养基（EMEM），获自ATCC（Manassas，VA）。 rMC-1Muuml;ller细胞（Muuml;ller细胞）由Vijay Sarthy博士（西北大学）慷慨提供。 如文献^[32]中所述合成并表征聚（原酸酯）聚合物。

• 1. 方法

2.2.1 聚（原酸酯）NP制剂

塞来昔布负载的聚（原酸酯）NPs是通过水包油[O / W] / W双乳液溶剂扩散技术制备的，只需稍作修改^[33]。简而言之，将聚（原酸酯）（90mg）和塞来昔布（60mg）溶解在乙酸乙酯（9ml）中。将有机相（18ml）加入到含有泊洛沙姆188（1.25％，w / v）的水溶液中，使乙酸乙酯和水相互饱和。通过使用微尖探针超声波仪（Sonicator Model S-4000; Misonic，Inc.，Newtown，CT）在65％强度下超声处理4m，在冰浴上超声处理形成初级O / W乳液。为了使乙酸乙酯扩散到水中，将该初级乳液滴加到水（72ml）中，在中等磁力搅拌下形成[O / W] / W双乳液。通过在磁力搅拌板上搅拌使有机溶剂蒸发过夜。通过超速离心（60,000rpm，2h，25℃）收集由此形成的NP，然后用水洗涤三次以除去未掺入的塞来昔布和泊洛沙姆188.洗涤三次后，将纳米颗粒沉淀物在20℃下用冷冻保护剂冷冻并冻结，然后在0.002的冻结干燥的Rabconco冷冻干燥机中冷冻。 mbar，-50℃，48小时（自由区，Labconco公司，堪萨斯州）。空白NP和尼罗红负载的NP以与上述相同的方式制备，不含塞来昔布。

2.2.2. 聚（原酸酯）NPs表征

通过动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）表征颗粒。 用含有Malvern Nano-ZS（马尔文仪器，伍斯特郡，UK）的Millipore水中的1mg / ml颗粒乳液进行DLS测量。 使用透射电子显微镜（JEM-2000 EX II Electron Microscope，JEOL，LTD，Tokyo，Japan），使用60kV的加速电压观察聚（原酸酯）NP的形态。 将2微升聚（原酸酯）NP（0.5mg / ml）置于铜网格的中心，并在电子显微镜下以适当的放大率观察网格。

2.2.3.体外药物释放

如前所述，制备塞来昔布的储备溶液用于标准曲线^[34]。 通过扫描合适的原液稀释液测定上述培养基中塞来昔布的lambda;最大值。塞来昔布在载药NP中的包封效率通过将载药NPs（10mg）的粉末溶解在1：1DMSO：去离子水（2ml）中来测定。样品在50rpm下旋转至少24小时以确保在DMSO水溶液中完全溶解。空白NPs的处理方式相同。通过用分光光度计（MQX 200，Bio-Tec Instruments，Vermont）测量251nm处的吸光度，然后从空白NP中减去吸光度值，测定所得溶液中塞来昔布的浓度。校准曲线的线性范围在1和20mu;g/ml之间，相关系数在0.999plusmn;0.00026之间变化。所有样品一式三份进行分析。

采用透析技术进行释放实验。塞来昔布释放曲线通过将载有药物的NP（30mg）悬浮于pH7.4的PBS（0.5ml）中并倒入供体室中来测定，而受体室填充0.5ml PBS。通过截留分子量为5kDa的纤维素膜（Harvard装置，Holliston，MA）分离供体和受体隔室，并在37℃下孵育，同时在培养箱振荡器（C24，新不伦瑞克科学，NJ）中以50rpm振荡。除去释放的培养基并用新鲜缓冲液替换。使用上述UV检测方法测定释放介质中塞来昔布的浓度。在整个释放研究中，从空白NPs收集的上清液的吸收在251nm处可忽略不计。每个样品中的药物量与每个先前时间点的量相加以获得累积药物释放量，并且总量除以总量。 NPs中的药物（包封效率乘以载药NPs的质量）来计算累积药物释放百分比。每个释放实验一式三份进行。

药物装载率(%) =装载在NPs中塞来昔布的重量/NP的重量times;100

封装效率(%) =NPs中装载的实际药物量/封装塞来昔布的初始量times; 100

2.2.4.乳酸测定

从聚（原酸酯）释放的乳酸是聚合物侵蚀开始的标志^[25]。因此，乳酸酸释放的重量的定量决定了聚（原酸酯）NPs是否正在侵蚀。 将空白NP（30mg）悬浮于PBS（0.5ml）中并用新鲜PBS（0.5ml）透析。 每天，收集乳酸释放的培养基并用新鲜PBS替换，并使用乳酸测定试剂盒（BioVision Inc，加利福尼亚州，USA）在释放介质中定量从NP释放的乳酸量。

2.2.5.体外细胞毒性测量

通过MTT测定评估聚（原酸酯）NP的体外细胞毒性。 将HEK 293细胞（4400个细胞/孔）接种到不透明的白色96孔板的每个孔中，并使其在潮湿的气氛（5％CO 2,37℃）中孵育过夜。 向每个孔中加入100微升稀释的NP（0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6和1mg / ml）储备溶液，并与细胞一起温育48小时，然后用生长培养基（160mu;l）代替。向每个孔中加入MTT试剂（40mu;l）以形成甲。在37℃温育2小时后，向每个孔中加入200mu;lDMSO以溶解甲晶体。 在5分钟后，在570nm处测量光学吸光度并相对于对照（未处理的）细胞（n = 4）转换成百分比存活率。

2.2.6.聚（原酸酯）NPs细胞摄取研究

定性：为了观察聚（原酸酯）NPs细胞缔合，在开始测定之前48小时将HEK 293和Muuml;ller细胞接种在24孔板（BD Biosciences，富兰克林湖，NJ）中。将尼罗红负载的NP稀释于培养基（0.2和1mg / ml）中，并加入单层HEK 293和Muuml;ller细胞中。然后将细胞在37℃下孵育2小时和24小时。细胞用PBS pH 7.4洗涤一次并在1％多聚甲醛中固定，然后用PBS中的TO-PRO-3碘化物（1：2000）标记它们的细胞核10分钟。用PBS洗涤细胞后，用Oregan 488 DHPE（10mu;g/ ml）标记细胞膜10分钟，用PBS彻底洗涤三次。将载玻片安装在载玻片上，并在共聚焦显微镜上拍摄图像（C1Plus; 尼康，东京，日本）。

定量：将HEK 293和Muuml;ller细胞与尼罗红负载的NP（0.2和1mg / ml）（20mu;g/ ml，1mg / mlNP乳剂）一起孵育2小时和24小时，如用于共聚焦显微镜中所述。在所有洗涤液和细胞裂解物中根据所有洗涤和细胞裂解物定量。文献^[35]中提到的方法。

1. 结果和讨论
   1. 聚（原酸酯）合成和表征

聚（原酸酯）合成涉及在对甲苯磺酸（一种酸性催化剂）存在下二醇，二醇 - 丙交酯和双烯酮缩醛之间的缩合反应^[32]。 在本研究中，使用3,9-二乙炔-2,4,8,10-四氧杂螺[5.5]十一烷，1,10-癸二醇和5摩尔％的d，l-丙交酯作为双烯酮缩醛，二醇和潜在的酸基团。 1,10-癸二醇和d，l-丙交酯是疏水的，与亲水性二醇和乙交酯相比，降解速率和药物释放速率更慢[36]。 通过质子核磁共振谱（1 H NMR）（图1a和表1）确认聚（原酸酯）结构，并且通过以下测量重均分子量（Mw）为5kDa（1.002 PDI）和22kDa（1.446 PDI）。凝胶渗透色谱法。

• 1. 聚（原酸酯）NP表征

粒径是一个重要参数，因为它可以直接影响物理稳定性，药物释放，生物分

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资料编号：[3690]