论文总字数：20446字

摘 要

黄素单核苷酸，即FMN，是核黄素生物体内存在的主要形式，参与细胞的氧化代谢过程，是体内不可缺少的一种物质。

本文介绍能够高产黄素单核苷酸（FMN）的黄素生成酵母假丝酵母重组菌株的构建，其中含有由强组成型启动子TEF1（翻译延伸因子1a）驱动的编码核黄素激酶的FMN1基因。这些菌株的转化与野生型菌株相比，在TEF1启动子下方包含FMN1基因的其他质粒导致核黄素激酶活性增加200倍，FMN产量增加100倍（仅在缺铁培养基中存在的一个特征）。

在铁充足的培养基中，核黄素生物合成途径失控且核黄素生成水平高的突变体中，FMN1基因的过表达导致核黄素激酶活性增加30倍，FMN产生的转化体增加400倍。获得的C. famata重组菌株可用于进一步构建改良的FMN过量生产。

关键词：无名假丝酵母菌株 基因工程 酶法制备

Study on Enzymatic Preparation of Flavin Mononucleotide

Abstract

FMN, a single base of flavin, is the main form of riboflavin in the body, is involved in the oxidative metabolism of cells, and is an essential substance in the body.

This article describes the construction of a flavin-producing yeast Candida recombinant strain capable of producing high flavin mononucleotide (FMN) containing the FMN1 gene encoding riboflavin kinase driven by the strong constitutive promoter TEF1 (translation elongation factor 1a). Transformation of these strains resulted in a 200-fold increase in riboflavin kinase activity and a 100-fold increase in FMN production with other plasmids containing the FMN1 gene under the TEF1 promoter compared to the wild-type strain (Function present only in iron-deficient medium).

In mutants with sufficient iron and an uncontrolled riboflavin biosynthetic pathway and high levels of riboflavin production, overexpression of the FMN1 gene resulted in a 30-fold increase in riboflavin kinase activity and 400 transformants produced by FMN. Doubled. The resulting C. famata recombinant strain can be used to further construct an improved FMN overproduction.

Key Words: C.famata; Genetic engineering; Enzymatic production

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1 前言 1

1.2 黄素单核苷酸的生产 1

1.2.1 黄素单核苷酸的生产现状 1

1.2.2 黄素单核苷酸的化学合成 2

1.2.3 黄素单核苷酸的生物合成 3

1.3 黄素单核苷酸的介绍 4

1.3.1 黄素单核苷酸的结构 4

1.3.2 黄素单核苷酸的理化性质 4

1.4 黄素单核苷酸产量的提升方法 5

1.4.1 引言 5

1.4.2 筛选高产的黄素单核苷酸菌株 5

1.4.3 基因组重排育种 5

1.4.4 提高菌株抗逆性能力 7

1.5 研究目的和工作内容 7

1.5.1 研究目的 7

1.5.2 工作内容 8

第二章 材料和方法 9

2.1 实验材料与仪器 9

2.1.1 实验药品 9

2.1.2 实验培养基 11

2.1.3 实验仪器 12

2.2 实验方法 13

2.2.1 菌株选择 13

2.2.2基因序列引物设计 13

2.2.3 PCR扩增 14

2.2.4 重组质粒的构建 14

2.2.5 FMN的制备 14

2.2.6 蛋白质浓度，核黄素激酶活性及FMN浓度测定 15

第三章 实验结果与分析 16

3.1 培养浓度对于产量的影响 16

3.2 核黄素激酶活性对产量的影响 17

3.3 各菌株产量的动态变化情况 19

第四章 结论与展望 21

4.1 结论与展望 21

参考文献 23

第一章 绪论

1.1 前言

我们人类不通过黄素单核苷酸这种有机物来吸收能源或组成身体器官，但是我们的每天的代谢过程却离不开它。而黄素单核苷酸这种物质又属于在高等动物体内不能合成的，需要通过食物来摄取。

黄素单核苷酸（FMN），是人和动物必备的有机化合物之一。核黄素在身体内以黄素单核苷酸的形式存在，黄素腺嘌呤二核苷酸是核黄素在体内的次要存在形式，它是黄素酶类的辅酶。它有帮助细胞的传递氢的代谢的功能。黄素单核苷酸是人体组织的氧化还原反应和呼吸链中电子转移的必需角色，并且在生命活动过程中也至关重要。

黄素单核苷酸作为人体生长发育必不可少的物质，不仅对人体的铁吸收和代谢有一定作用，而且还具有抗氧化功效。此外，黄素单核苷酸还对心血管疾病的治疗有作用，可以降低血脂。人体每天应摄入1.5 g左右的黄素单核苷酸，当摄入不足时，会出现机体无力，无食欲，甚至会引发各种炎症。黄素单核苷酸对禽畜的体重，肉的产量、品质等有着积极作用。每千克的饲料应添加5 mg的黄素单核苷酸。

综上所述，黄素单核苷酸在医用，饲料，食品等各个产业都有着不可缺少的作用，它有着巨大的发展潜力。

1.2 黄素单核苷酸的生产

1.2.1 黄素单核苷酸的生产现状

传统上，核黄素是化学合成的，用于食品和饲料的强化。最近，采用各种细菌，酵母和真菌的生物技术工艺已经具有商业竞争性，并且正在逐渐取代化学合成方法^[1]。相比之下，磷酸化的黄素衍生物黄素单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸仍主要通过化学合成来生产，这是通过在γ-丁内酯中使用磷酰氯作为溶剂，通过核黄素的磷酸化来完成的。需要繁琐和昂贵的下游处理，以将相应的磷酸化黄素与未反应的核黄素和反应副产物分离。黄素是体内许多生物反应的重要辅酶并因此需要的生化反应，以及用于医疗应用^[2]。因此，最理想的是开发一种适于直接从微生物宿主中过量生产和纯化磷酸化黄素的生物系统。因此，近年来已使用代谢工程来获得过量生产黄素单核苷酸的大肠杆菌，肠杆菌或芽孢杆菌。通常，这些菌株过表达双功能黄素激酶/黄素单核苷酸腺苷酸转移酶，并需要向培养上清液中添加大量昂贵的ATP和核黄素以克服由于黄素单核苷酸抑制核黄素生物合成而导致的核黄素可用性限制。因此，难以选择性地上调黄素单核苷酸产生而不影响核黄素生物合成的细菌核黄素过量生产的菌株如枯草芽孢杆菌的代谢工程似乎是困难的^[3]。

最近已经开发了一种新型的生物生产系统，该系统通过使用辅助因子捕获技术可产生高纯度的黄素单核苷酸^[4]。该策略不依赖于代谢或以其他方式设计的黄素单核苷酸过量生产者，而是使用表达黄素单核苷酸结合黄素蛋白的标准大肠杆菌菌株，该菌株将大部分细胞黄素单核苷酸捕获在蛋白质内，从而从调节级联的生物合成中去除黄素单核苷酸^[5]。在生物催化生产工艺，原位产物去除早已被用于除去抑制性或有毒产品。此类体外策略通常依赖于使用物理吸附，液-液萃取或蒸馏在生物转化过程中从生物反应器中除去产物。相反，辅助因子捕获方法代表体内方法，其中发酵过程中将产物黄素单核苷酸隔离并存储在细胞内^[6]。

1.2.2 黄素单核苷酸的化学合成

黄素单核苷酸是一个复杂的异咯嗪衍生物，1934年，两位科学家研究出了化学法生产黄素单核苷酸的方法，之后这种方法被国外各大医药公司引用，被应用了将近60年，这种方法使用的原料是葡萄糖，它具有成本低，产率高等优点^[7]。

请支付后下载全文，论文总字数：20446字