论文总字数：32756字

摘 要

新兴的合成生物学，通过代谢工程对底盘细胞的代谢途径进行设计、构建以及优化，从而实现了绿色环保的生物制造，在实现可持续发展上，有着传统化学化工无可比拟的优势。然而外源途径基因的不平衡表达以及有毒中间代谢产物的积累往往会影响宿主细胞的正常生长。

通过感应光、温度、PH等环境条件等动态手段调控细胞生长和产物合成之间的矛盾。其中，温度是一个环境线索，它会影响每一个细胞过程。为了应对突然的温度变化，所有活细胞通过许多感官机制密切地观察它们的环境温度。本文构建温敏元件E1TS和NONTS控件。低温时，E1TS形成“发夹”结构，切割位点被隔离，表达处于“on”状态。高温时，茎环展开，切割位点暴露，mRNA降解，表达处于“off”状态。观察在27℃和37℃下的表达情况，E1TS温敏元件低温时的表达状态优于高温状态。NONTS控件缺少形成茎环的部分结构，应该一直处于“off”状态。而观察在27℃和37℃下的表达情况，NONTS控件与温度没有相关关系。本文为后期成功构建温敏元件提供了前期参考，也为温度调控体系的设计与构建提供了思路与借鉴。

。

关键词：合成生物学 动态调控 温敏元件

Construction of temperature-sensitive element based on mRNA secondary structure

Abstract

The emerging synthetic biology, through metabolic engineering, designs, constructs and optimizes the metabolic pathway of chassis cells, thus realizing the green and environmentally-friendly biological manufacturing. In the realization of sustainable development, it has incomparable advantages over traditional chemical and chemical industries. However, the unbalanced expression of exogenous genes and the accumulation of toxic intermediate metabolites often affect the normal growth of host cells.

The contradiction between cell growth and product synthesis was regulated by dynamic means such as sensing light, temperature, PH and other environmental conditions. Among them, temperature is an environmental cue that affects every cellular process. In response to sudden temperature changes, all living cells closely observe their ambient temperature through a number of sensory mechanisms. This article builds temperature-sensitive components E1TS and NONTS controls. At low temperature, E1TS forms a "hairpin" structure, the cutting site is isolated, and the expression is in the "on" state. At high temperature, the stem ring was expanded, the cutting site was exposed, the mRNA was degraded, and the expression was in the "off" state. The expression of E1TS at low temperature was superior to that at high temperature. The NONTS control lacks the part structure that forms the stem ring and should always be in the "off" state. NONTS controls were not temperature-dependent when observed at 27℃ and 37℃. This paper provides a reference for the successful construction of temperature sensor in the early stage, and also provides a train of thought and reference for the design and construction of temperature control system.

Key Words: Synthetic biology; dynamic controlling; temperature-sensitive element;

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1合成生物学的现状 1

1.1.1代谢工程在合成生物学中的应用 1

1.1.2静态调控存在的问题 2

1.2动态调控 2

1.2.1现有的调控手段 3

1.2.2温度调控的优势 5

1.2.3温度调控的现状 5

1.3小结 6

第二章 实验材料和方法 7

2.1实验材料 7

2.1.1实验菌株和质粒 7

2.1.2实验仪器 7

2.1.3实验引物及基因序列 8

2.1.4实验试剂 10

2.1.5培养基和其它溶液 13

2.2实验方法 13

2.2.1质粒提取 13

2.2.2DNA产物回收 14

2.2.3质粒pCDF-E1TS、pCDF-NONTS的构建 14

2.2.4温敏元件的试用 17

2.2.5RNase E救援菌株构建 19

2.2.6重组菌的诱导表达 21

第三章结果与讨论 22

3.1质粒pCDF-E1TS、pCDF-NONTS构建 22

3.1.1目的片段的扩增 22

3.1.2pCDF-E1TS、pCDF-NONTS的转化及菌落PCR 22

3.2温敏元件的使用 23

3.2.1绿色荧光蛋白基因gfp的扩增 23

3.2.2 pCDF-E1TS-gfp、pCDF-NONTS-gfp的转化及菌落PCR 24

3.3重组菌的诱导表达 24

3.3.1pCDFD-E1TS-gfp、pCDFD-NONTS-gfp诱导表达 24

3.3.2讨论 26

3.4 RNase E营救实验 26

3.4.1 RNase E合成相关基因的扩增 26

3.4.2 pCDF-E1TS-RNase E、pCDF-NONTS-RNase E的转化及菌落PCR 27

3.4.3 RNase E的表达 28

3.4.4 pCDFD-E1TS-RNase E、pCDFD-E1TS-RNase E营救情况 28

3.4.5讨论 29

第四章结论与展望 30

4.1结论 30

4.2展望 30

参考文献 31

致谢 35

第一章 绪论

1.1合成生物学的现状

合成生物学是一门把工程学的理念和生物科学的知识结合的新兴学科。利用基因工程和代谢工程手段，构建规范的构件、组件和系统，在现有的自然系统上进行规划和创新，获得具备新功能的人工生物系统，也可以设计和构建一个全新的功能性生物系统。合成生物学在生物医药开发、生物新能源开发、新材料合成、珍惜资源量产化、环境保护等方面都有广阔的应用前景。例如新型疫苗的研发和产业化，开发可将糖类直接转化成生物燃油的人工合成细菌，微生物改造后处理水污染、核废料，生物材料（如聚羟基脂肪酸酯、聚乳酸）的生产^[1]等。“合成生物学”给生物技术产业带来了空前的变革，被誉为可改变世界的十大新技术之一^[2]

1.1.1代谢工程在合成生物学中的应用

请支付后下载全文，论文总字数：32756字