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摘 要

转录谱测序是指通过测定在特定发育阶段或生理状态下的细胞内的全部RNA序列，并对差异表达的基因进行富集分析，探究其生理状态的改变与基因层面的改变间的深层次的关系。本文以实验室构建的酵母异源表达菌BY4741- SCNA为研究对象，在无胁迫和氧化胁迫条件下进行转录谱测序分析，进一步探讨氧化胁迫下α-synuclein表达对重组菌产生影响及其内在联系。分析结果显示，氧化胁迫条件下重组菌BY4741-pYX212-SCNA与对照菌BY4741-pYX212差异表达基因中122个基因下调，141个基因上调，主要涉及氧化磷酸化、三羧酸循环、维生素B1代谢等代谢途径，本文主要分析了与硫胺素代谢与α-syn易位线粒体之间的关系，为之后研究α-syn在帕金森病中的致病机制提供了一定基础。

关键词：转录谱分析 α-syn表达 帕金森病 异源表达菌

Sequencing and preliminary analysis of transcription profile of α - synuclein heterologous expression yeast

Abstract

Transcription profiling refers to the deep-seated relationship between changes in physiological state and changes in gene level by measuring all RNA sequences in cells at a specific stage of development or physiological state, and enriching and analyzing differentially expressed genes. In this paper, we used BY4741-SCNA constructed in laboratory as the research object, and analyzed the transcription spectrum under the condition of no stress and oxidation stress, and further explored the influence of α-synuclein expression on recombinant bacteria under oxidation stress and its internal relationship. The results showed that 122 genes were down-regulated and 141 genes were up-regulated in the differentially expressed genes of recombinant BY4741-pYX212-SCNA and control BY4741-pYX212 under oxidative stress, which were mainly involved in oxidative phosphorylation, tricarboxylic acid cycle, vitamin B1 metabolism and other metabolic pathways. This paper mainly analyzed the relationship between thiamine metabolism and α-syn translocation mitochondria, for the later study of α-syn The pathogenetic mechanism of Bai in Parkinson's disease provides a certain basis.

Key words: Transcriptome analysis; Parkinson's disease; Heterologous expression bacteria; α - syn expression

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1酿酒酵母 1

1.1.1简介 1

1.1.2酿酒酵母的优势 1

1.2 α-synuclein 1

1.2.1 α-synuclein的简介 1

1.2.2帕金森病的简介 2

1.2.3 α-synuclein与帕金森的关系 2

1.2.4氧化应激与帕金森病 3

1.3转录组学研究进展 4

1.3.1转录组学简介 4

1.3.2转录组测序技术 4

1.3.3转录组测序技术的优势 5

第二章 实验部分 6

2.1实验材料 6

2.2实验方法 7

2.2.1基本实验流程 7

2.2.2相关实验方法 9

第三章 结果与讨论 10

3.1 RNA样品质量检测 10

3.2 原始数据的处理、过滤及碱基分布 10

3.2.1 数据处理 10

3.3 比对分析 11

3.3.1 比对结果统计 11

3.3.2 比对区域的分布统计 11

3.4氧化应激水平下重组菌与对照菌差异表达基因功能富集分析 11

3.5 差异表达基因中关键途径和基因的筛选 14

结语 18

参考文献 19

致谢 23

第一章 绪论

1.1 酿酒酵母

1.1.1 简介

酿酒酵母是一类单细胞真核微生物的统称，种类不同，酿酒酵母的细胞形状大小差别也很大，形状通常为球形或卵形，直径在1～5μm之间,长度在5～30μm1^[1]。同动植物细胞相比，酿酒酵母的许多结构都与其有相似之处。早在古代的时候，酿酒酵母就被用与人类的生产活动中。在很多国家地区，很早就有用酵母来发面、酿酒酿酒的历史，这些生产方式也一直沿用至今。近代以来，酿酒酵母开始广泛应用于工业生产，它在酿酒、畜牧养殖业、饲料工业、生物科研、医药生产等方面都有着突出的贡献。

1.1.2 酿酒酵母的优势

与同类发酵菌株相比，酿酒酵母有着很多明显的优势，因此在研究真核生物时，酿酒酵母是经常会用到的模式生物^[2]。本设计选用酿酒酵母做研究对象，有以下几个原因：第一，酿酒酵母可不依赖呼吸而存活，因此可用于研究线粒体功能障碍；第二，酿酒酵母的代谢方法多，很多途径在动物身上也有，可以成为本实验研究的主要方向；第三，酿酒酵母在实验室中的培养应用已相当成熟，有较多可以借鉴的成熟经验^[2]。

1.2 α-syn与帕金森病

1.2.1 α-syn的简介

α-突触核蛋白（α-synuclein，α-syn）本质上它是一种无序的可溶性单体蛋白，由SNCA基因编码，大脑的很多组织中都发现了该蛋白，在大脑中，α-syn主要存在于被称为突触前末梢的特殊结构中的神经元尖端，而在心脏和其他组织中较少发现 ^[3]。人类的突触核蛋白的重要形式有三种：α-syn、β-syn以及γ-syn，其中α-syn与帕金森病致病的因素之一^[4]。正常水平时，α-syn可以保护突触功能，并且能调节多巴胺的生物合成，同时还对细胞有保护功能^[5]。

1.2.2 帕金森病的简介

帕金森（Parkinson disease，PD）是一种运动障碍，其特征是震颤、僵硬、肌肉无力和姿势反射丧失，常导致静止不动和频繁跌倒，在PD的后期还会导致认知障碍^[6]。此外，有很多PD患者会出现非运动症状，这些症状可能比常规运动症状早20年^[7]。科学家们普遍认为是遗传与环境因素共同作用诱发PD的，但是目前仍没有掌握具体的分子机制，现在PD仍然没有办法完全治愈。

帕金森病是大脑黑质多巴胺能神经元选择性丢失的结果，PD在病情步入中后期时，会慢慢对中脑产生影响，从而时基底神经节环路神经递质乙酰胆碱与多巴胺的平衡被打破 ^[8]。中脑黑质（DN）的变性被认为是帕金森病致病的主要原因，纹状体多巴胺（DA）的含量会因此大量减少，最终引发疾病^[9]。这种疾病的主要特征是神经元中出现不包涵体——路易体，路易体其主要成分是突触核蛋白^[9]。目前关于PD致病的学说有：线粒体功能障碍、中枢炎症、氧化应激反应以及兴奋性毒性等 ^[10]。研究人员普遍认为PD是环境、基因以及年龄等多种因素共同作用导致的结果，各种外源刺激如：接触有机化学品、一氧化碳、二氧化碳、植物源性毒素、细菌和病毒等，都可能成为PD的诱因^[11]。

1.2.3 α-syn与帕金森的关系

很多研究都表明α-syn异常是引起帕金森病的一个重要因素，α-syn的部分基因突变会引起家族性帕金森病。α-syn不仅可以保障突触的正常功能，而且还参与调节多巴胺的合成，当外界出现刺激时，α-syn还会集合起来抵御损伤^[12]。但是随着α-syn的不断增多，会使得线粒体受到损伤，当这种损伤超出细胞可调节的范围时，会产生细胞毒性，最终使细胞致死^[13]。

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