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摘 要

酿酒酵母是一种工业模式微生物，在我们的生产生活中起到至关重要的作用。但是，在实际生产中，若遇到高温环境，菌种发酵性能会有所降低，发酵周期延长，对生产的产品质量和效率都会造成影响。因此，本课题选择对酿酒酵母的耐热性进行分析研究。大量文献报道酵母菌的耐热性与海藻糖的含量有一定关系，本文选择以酿酒酵母模式菌BY4741为研究对象将海藻糖代谢途径中海藻糖合成前体UDP-葡萄糖的合成基因UGP1敲除，分析结果结果显示在42℃热胁迫条件下，△UGP1菌株的存活率会随着时间的增加而产生下降趋势，在热激2 h时，存活率为34.13%；热激8 h时，存活率下降至8.51%。本文分析了UGP1与酿酒酵母耐热性的关系，为研究具有耐热性的酿酒酵母提供了一定基础。

关键词 ：UGP1基因缺陷型菌株 酿酒酵母 耐热性

Heat resistance analysis and mechanism study of △UGP1 strain

Abstract

Saccharomyces cerevisiae is an industrial model microorganism, which plays an important role in our production and life. However, in the actual production, if the high temperature environment is encountered, the fermentation performance will be reduced, and the fermentation cycle will be extended, which will affect the quality and efficiency of the products. Therefore, this study chooses to analyze the heat tolerance of Saccharomyces cerevisiae. Therefore, the model strain of Saccharomyces cerevisiae BY4741 is selected as the research object to knock out the synthesis gene ugp1 of UDP glucose, The results showed that under 42 ℃ heat stress, the survival rate of △ ugp1 strain would decrease with the increase of time, the survival rate was 34.13% in 2 hours of heat shock and 8.51% in 8 hours of heat shock. In this paper, the relationship between ugp1 and thermotolerance of Saccharomyces cerevisiae was analyzed, which provided a basis for the study of thermotolerance of Saccharomyces cerevisiae.

Key Words: UGP1 genodefective strain；saccharomyces cerevisiae ；Heat resistance

目录

摘 要 II

Abstract III

第一章 绪论 6

1.1UGP1 6

1.1.1 UGP1作用简介 6

1.1.2 UGP1 的表达及影响 6

1.2 酿酒酵母 6

1.2.1海藻糖与 酿酒酵母的耐热机制 6

1.2.2耐热 酿酒酵母的研究意义 7

第二章 实验部分 8

2.1实验材料 8

2.1.1 菌株与质粒 8

2.1.2 药品与试剂 8

2.1.3 实验仪器 9

2.2 实验方法 10

2.2.1. 制备培养基 10

2.2.2引物 10

2.2.3大肠杆菌电击感受态细胞的制备 10

2.2.4 质粒pUG6和pRS415-pr^THI4-UGP1-GFP的转化 11

2.2.5用碱裂解法制备pRS415-pr^THI4-UGP1-GFP和pUG6质粒DNA 11

2.2.6 制备酿酒酵母电击感受态细胞 12

2.2.7 酿酒酵母的电击转化 12

2.2.8菌落PCR验证 12

2.2.9 Q-PCR分析UGP1转录水平变化 13

2.2.10.UGP1缺陷型菌株在热胁迫下测定其存活率 14

2.2.11.UGP1缺陷型菌株海藻糖含量测定 14

2.2.12. UGP1缺陷型菌株细胞壁葡聚糖含量的测定 15

第三章 实验结果与讨论 16

3.1 实验结果 16

3.1.1 .验证质粒pRS415-prTHI4-UGP1-GFP的提取 16

3.1.2 质粒pRS415-prTHI4-UGP1-GFP的转化与验证 16

3.1.3构建UGP1基因敲除盒 17

3.1.4 UGP1基因敲除序列组件的转化及筛选 18

3.1.5测定UGP1缺陷型菌中UGP1的转录水平 19

3.1.6 UGP1缺陷型菌株热胁迫下测定其存活率 20

3.1.7 UGP1缺陷型菌株热胁迫下测定海藻糖含量 21

3.1.8UGP1缺陷型菌株热激条件下测定葡聚糖含量 21

3.2 讨论 22

结语 23

参考文献 24

致谢 27

第一章 绪论

1.1UGP1

1.1.1 UGP1作用简介

UGP1是UGPase中占主导地位的基因^[1]，UGPase是植物，动物和细菌中普遍存在的一种酶^[2]，它产生的UDP-葡萄糖是所有生命体中多糖的主要糖基供体^[3]。UGP1具有典型的UGP基因组织，这些基因编码了氨基酸残基，这些氨基酸残基是UGPase催化和底物结合所必须的。因此，UGP1作为一个重要基因，其表达会影响生命体的生存能力，包括耐热性^[4]。

1.1.2 UGP1 的表达及影响

UGPase被视为碳水化合物代谢的关键酶,因为它的代谢产物UDP-Glc被用作几个重要的细胞过程如结构碳水化合物的合成等^[5]。UGP1作为UGPase的重要基因，其表达水平会影响UGPase在生命体中的含量，UGPase是碳水化合物代谢的关键酶，其表达水平会影响生命体UDP-葡萄糖的产生，UDP-葡萄糖是细胞内多糖的代谢前体^[6]，因此UGP1基因会影响酿酒酵母菌株内重要碳水化合物的合成，由此可见，UGP1的表达影响细胞的耐热性及长期存活^[7]。

1.2 酿酒酵母

1.2.1海藻糖与 酿酒酵母的耐热机制

耐热酿酒酵母是指在超过40的环境下可以正常生存的酿酒酵母^[8]。 酿酒酵母耐热机制通过很多途径，主要因素包括：应激糖蛋白、热激蛋白（HeatShockProtein,HSP)ATPase、谷胱甘肽（GSH）及海藻糖等^[9]。下面主要对海藻糖作简单介绍。

海藻糖可以保护细胞膜结构以及蛋白质，因此海藻糖与酵母菌耐热性密不可分^[10]。
现在，对于海藻糖和酿酒酵母耐热性的联系，一共存在3种假说来说明海藻糖的保护作用：①海藻糖自身的作用：在高温环境下，海藻糖通过与蛋白质表面的一些亲水基团相结合，降低了蛋白质中的疏水基团的暴露程度^[11]，从而可以避免由于热激反应导致的蛋白质凝聚，这样使得蛋白质的结构可以在较高温度下保持稳定，酿酒酵母的生存能力得到提高。②Hsp104与海藻糖的联合作用：研究发现，分子伴侣Hsp104在海藻糖的帮助下可以对热休克蛋白进行重新折叠^[12]。在外界温度升高时，海藻糖可以防止蛋白质受热降解，可以稳定蛋白质，等到Hsp104与蛋白质结合发挥作用以后，酿酒酵母便可以继续生存^[13]。③海藻糖合成基因的作用：最近有学者发现，海藻糖很有可能并没有那么大的保护作用^[14]，实验发现，与野生型酿酒酵母相比，海藻糖合成基因TPS1缺陷型的耐热性较差^[15]，而奇怪的是，添加外源性海藻糖以后，酿酒酵母的耐热性并没有得到回复，说明可能是TPS1基因的存在影响了酿酒酵母的耐热性而并不是海藻糖^[16]，由于UGP1基因合成的UDP-葡萄糖是合成海藻糖的前体物质，因此UGP1基因与酿酒酵母的耐热性密切相关，这也正是本课题研究的问题所在。

1.2.2耐热 酿酒酵母的研究意义

酿酒酵母是第一个被测出所有基因组序列的真核生物，在20世纪70年代，随着基因组学的快速发展，基因敲除技术就应用于酿酒酵母，让人们对酿酒酵母细胞中的各段基因的功能有了更加深入的了解，这为本课题的开展奠定了夯实的基础^[17]。

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