1. 研究目的与意义（文献综述）

肿瘤一直是一个困扰全世界的重大公共卫生问题。随着人口的不断老龄化，癌症带给我们的负担日益加重，肿瘤类疾病每年都会剥夺成百上千万的生命，且有趋势超过心脑血管疾病成为第一大致死因素。

能够治疗乳腺癌的中药有 85 种，其中 69 种中药材已被 2015 版《中国药典》收录，16 种中草药未被收录。这些中草药中治疗乳腺癌的主要药用成分为生物碱、苷类、酚类、萜类、糖类、挥发油、香豆素等。

肿瘤是一种多复杂机制的疾病，早期的治疗方法有外科手术、放疗、化疗等手段，会带来一些副作用，对患者带来一些不必要的身体损伤，比如临床上治疗过程中出现恶心、呕吐、头晕、头痛等。乳腺癌治疗主要以化疗、放疗以及手术为主，在此基础上研究获得了治疗乳腺癌的新型抗体药物和最新医疗方法。但由于大多数抗癌药物往往会对正常乳腺细胞产生毒性或者癌细胞对药物产生耐药性。

2. 研究的基本内容与方案

4.1研究目标：

通过纳米粒沉淀法制备包载和厚朴酚的PEG-PLA胶束，对纳米粒的粒径、包封率、载药量、Zeta电位进行测定，进行处方优化，然后进行纳米粒的体外释放率测定，为临床治疗和预防乳腺癌的给药方式提供一些新思路。

4.2研究内容：

①和厚朴酚的体外分析学的建立

②载药PLEG-PLA纳米粒的制备及表征

4.拟采取的研究方法、技术路线；

4.1和厚朴酚的体外分析学的建立

（1）和厚朴酚标准储备液的配制

精确称取5.0mg，用乙腈定容到50ml的容量瓶中，摇匀超声，可得0.1mg/ml的和厚朴酚标准储备液，放在4℃冰箱中保存，于 3 日内使用。避光低温保存。

（2）全扫描确定和厚朴酚的最大吸收波长：

移取1mL和厚朴酚标准品储备液于10mL棕色容量瓶中，乙腈定容至刻度，得10μg/mL的和厚朴酚溶液。以乙腈为空白对照，紫外分光光度计扫全波长，确定λmax。取一定的载体溶液，用乙腈稀释至适当浓度。均以乙腈为空白对照，紫外分光光度计扫全波长，在200-800nm范围内进行紫外扫描确定λmax。

（3）标准曲线的建立：

分别精密量取上述储备液置于10ml容量瓶中，加乙腈定容至刻度，配制浓度为2、4、8、16、32μg/ml的系列标准溶液，以乙腈为空白溶液，在λmax处测定吸光度（Abs），将浓度（C）和对应的吸光度（Abs）进行线性回归，绘制标准曲线。

4.1.2载药mPEG-PLA纳米粒的制备及表征

4.2.1纳米粒沉淀法制备载和厚朴酚纳米粒

（1）空白纳米粒的制备

参考文献采用纳米粒沉淀法制备纳米粒。具体步骤为：精密称取48mg mPEG2000-PLA4000加入0.5ml乙腈中，超声使其溶解；在搅拌下，用1mL注射器将 溶液缓慢的注入到5ml水溶液中，在25℃温度500rpm转速下恒速搅拌水化，mpeg-pla聚合物在水中自组装得到目标产物空白纳米粒溶液，待冷却至室温后将制备好的空白纳米粒溶液反复通过 0.22 μm 的滤膜，空白纳米粒滤液保存于 4℃冰箱并在 30 min 内使用。

（2）载和厚朴酚纳米粒的制备

采用纳米粒沉淀法

载和厚朴酚纳米粒的制备：精密称取适量的和厚朴酚、48mg mPEG2000-pla4000溶于 0.5m L乙腈中，超声使其溶解，超声使其溶解；在搅拌下，用1mL注射器将 溶液缓慢的注入到5ml水溶液中，在25℃温度500rpm转速下恒速搅拌水化，mpeg-pla聚合物在水中自组装得到目标产物空白纳米粒溶液，待冷却至室温后将制备好的空白纳米粒溶液反复通过 0.22 μm 的滤膜，空白纳米粒滤液保存于 4℃冰箱并在 30 min 内使用。

4.2.2包封率和载药量的测定

重点考察纳米粒包封率；将新制的纳米粒悬液，高速冷冻离心机10000rpm离心5min，精密量取稀释的纳米粒溶液0.5 mL，用0.45 μ m微孔滤膜滤去未包封的药物，取50μl，将滤液用乙腈破乳，定容4mL，UV法测定含量；（载药mPEG-PLA 纳米粒经破乳后，分别按照前一章建立的和厚朴酚的 UV检测方法进行分析。）；再取载药纳米粒冷冻干燥，获得得载药纳米粒的重量。

包封率（encapsulation efficiency，EE）=纳米粒包载药物的质量/投药量×100%；

载药量（drug loading，DL）=纳米粒包载药物的质量/载药纳米粒的总质量×100%。

4.2.3纳米粒的处方优化

载药纳米粒：

纳米粒沉淀法制备mPEG- PDLLA纳米粒，重点考察优化给药量（4.8，6,8mg），温度（25,30,35℃），有机相与水相体积比（1:5,1:10,1:20）对包封率和粒径的影响。

（1）固定药物量为8mg，载体为48mg，有机相与水相体积比为1:10，考察温度对粒径，PDI,，Zeta，包封率的影响，筛选出最佳温度；

（2）固定药物量为4.8mg，载体为48mg，温度为筛选出的最佳温度，考察有机相与水相体积比对粒径，PDI,，Zeta，包封率的影响，筛选出水相与有机相最佳体积比；

（3）固定水相与有机相体积比为筛选出的最佳体积比，温度为筛选出的最佳温度，载体为48mg，考察给药量对粒径，PDI,，Zeta，包封率的影响，筛选出最佳给药量。

4.2.4mPEG-PLA纳米粒的表征

（1）纳米粒粒径和 Zeta 电位的测定

取空白或载药纳米粒 50μL，用超纯水稀释至 3m L，置于粒径或电位测量皿中，用 Zetasizer nano ZS 激光粒度分析仪测定其Size、PDI和Zeta电位。

（2）透射电子显微镜（TEM）观察mPEG-PLA纳米粒的表观形态及粒径

取新制得的纳米粒溶液，滴加一滴样品至透射电镜（TEM）专用的300目碳膜铜网上，待其挥发干后，滴加新配制的 2%（m/v）磷钨酸溶液，染色 5min，用滤纸吸干多余染色液，挥干溶剂，用 TEM 观察纳米粒的形态。

（3）纳米粒稳定性考察

将制备好的载药纳米粒放置于 4 ℃冰箱中保存，通过测定纳米溶液在水溶液中的粒径变化，考察在药纳米粒在 4 ℃条件下的稳定性，每隔一天测一次，共测定 4 次。

（4）载药纳米粒的体外释放实验

为模拟中性的正常体内环境和偏酸性的肿瘤组织环境中的药物释放，分别用 p H为 7.4 和 5.0 的 PBS作为模拟释放介质，对载药mpeg-pla纳米粒进行体外释放检测。

取 1m L 新制备的载药胶束置于经过预处理透析袋（透析袋截留分子量为3.5KDa）中；用磷酸将含有 0.1%吐温-80的PBS 缓冲溶液的 p H 值分别调至 p H7.4和 pH5.0，以模拟血液环境和肿瘤微环境中的 p H 值（50ml离心管中）；再将含有载药纳米粒的透析袋分别置于 20m L不同 pH 值PBS 缓冲溶液中，每个p H 条件下平行做 3份样品，拧紧管盖后，置于恒温摇床中，设置温度为37℃，振荡速度为 100rmp。分别在0，0.5，1，2，4，6，8，10，12，24，34，36，48，72 h时间点处取释放介质 2m L，并补加 2m L 相对应的释放介质，以维持漏槽条件；按照前章所建立的和厚朴酚检测方法测定各时间点的样品浓度，计算药物的累积释放率并绘制释放曲线。

药物的累积释放率(CR)计算公式为：

CR_n = {[C_n*V₀ (C₁ C₂… C_n-1)*V]/m₀}×100%

CR_n：第 n 次取样的累积释放率；C_n：第 n 次取样时所测得的浓度；V₀：溶液总体积(包括分散介质和释放介质)；V：每次取样的体积；m₀：总药量。



4.5技术路线

3. 研究计划与安排

第1－2周：查阅相关文献资料，确定研究方案，完成开题报告。
第3-6周：完成塞来昔布纳米粒的制备。

第7-12周：完成塞来昔布纳米粒的表征。
第13－14周：完成并修改毕业论文。
第15周：准备论文答辩。

4. 参考文献（12篇以上）

[1]. chen, wanqing;zheng, rongshou;baade, peter d.; et al.cancerstatistics in china[j]. ca: a cancer journalfor clinicians,2016,66(2)：115.

[2]. dobbelsteinm,oll u.targetingtumour-supportive cellular machineries in anticancer drug development[j].natrev drug discov,2014,13(3):179-196.

[3].teng w, zhen c, yifei z, et al. inhibition of transient receptor potential channel 5 reverses 5-fluorouracil resistance in human colorectalcancer cells[j]. journal of biological chemistry, 2014.