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摘 要

环磷酸腺苷（cAMP）被称为细胞第二信使，参与各种代谢反应，放大某些激素的生理效应。cAMP在药物合成、内分泌、疾病治疗和辐射防护等方面中有着广泛应用。腺苷酸环化酶（AC）活化后，催化ATP生成cAMP,从而进行一系列生理反应。但是游离酶稳定性差、难以重复利用，无法适用于工业化生产。本文使用带有组氨酸标签的AC进行研究，选用二氧化钛（TiO₂）作为固定化载体，并使用多巴胺（PDA）和聚乙烯亚安（PEI）共沉积修饰，在TiO₂表面形成氨基柔性链，同时螯合金属离子镍（Ni² ）实现酶的亲和固定。结果表明，固定化酶的热稳定性有所提高，适用的PH范围更宽。

关键词：载体，表面修饰，二氧化钛，腺苷酸环化酶，环磷酸腺苷，亲和固定

Abstract

Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) is called the second messenger of cells, which participates in various metabolic reactions and amplifies the physiological effects of some hormones. CAMP is widely used in drug synthesis, endocrine, disease treatment and radiation protection. After activation, adenylate cyclase (AC) catalyzes ATP to generate cAMP, thus carrying out a series of physiological reactions. However, the free enzyme has poor stability and is difficult to reuse, which is not suitable for industrial production. In this paper, histidine-tagged AC is used for research, titanium dioxide (TiO2) is selected as the immobilization carrier, dopamine (PDA) and polyethyleneimine (PEI) are used for co-deposition modification, amino flexible chains are formed on the surface of TiO2, and metal ion nickel (Ni2 ) is chelated to realize affinity immobilization of enzyme. The results showed that the thermal stability of immobilized enzyme was improved and the applicable PH range was wider.

Key words: carrier, surface modification, titanium dioxide, adenylate cyclase, cAMP, affinity immobilization

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章文献综述 1

1.1固定化酶概述及研究现状 1

1.2腺苷酸环化酶及环磷酸腺苷 1

1.3载体材料的简介 2

1.3.1 高分子载体 2

1.3.2 无机载体 3

1.3.3复合材料 3

1.3.4新型载体 3

1.4 固定方法的选择 4

1.4.1传统方法 4

1.4.2亲和固定化 5

1.5研究意义 5

第二章实验方案 6

2.1 引言 6

2.2实验材料与仪器 6

2.3实验方法与实验步骤 7

2.3.1细菌培养与破碎 7

2.3.2溶液的配制 8

2.3.3 载体的制备 8

2.3.4固定化酶的制备 9

2.4酶活力以及蛋白载率测定 9

第三章结果与讨论 11

3.1 固定化载体的表征 11

3.1.1形貌表征 11

3.1.2孔结构表征 12

3.1.3FT-IR表征 13

3.1.4X-射线衍射图谱 13

3.1.5热重分析 15

3.2固定化酶活力的比较 15

3.3固定化酶过程中的条件优化 16

3.4 温度稳定性和pH稳定性比较 19

第四章结论与展望 20

4.1 结论 20

4.2 展望 20

参考文献： 21

致 谢 24

第一章文献综述

1.1固定化酶概述及研究现状

酶是由活细胞产生的生物大分子，具有催化功能，可分为蛋白酶和核酸酶，具有高效性和专一性等特点^[1]。酶的种类繁多，应用广泛，在药学、洗涤剂^[2]和食品加工^[3]等方面有着很大的应用价值。然而，大多数天然酶作为游离酶应用在工业生产中时，其活性易受pH、温度等影响，导致其性质变化，且产物不利于与底物分离，从而加大了回收难度，也难以实现最终产物的分离、纯化，所以天然酶难以应用于大规模工业生产。20世纪60年代，固定化酶的研究迅速兴起，90年代已形成传统的固定方法，有效的的解决了这类问题，取得了令人鼓舞的成果。

酶的固定化(Immobilization of enzymes)是指使用物理或化学方法将酶束缚或限制一些能充当载体的材料内，进行催化反应^[4]。和游离酶相比，固定化酶同样也具有专一性、高效性，又拥有游离酶没有的优点，比如易储存、可分离回收、可多次使用且酶稳定性增强，这样使工艺更加简便^[5]。固定化酶研究已在各个领域兴起，比如在食品工业、医药领域、生物工程学等。

1.2腺苷酸环化酶及环磷酸腺苷

腺苷酸环化酶(AC) 和环磷酸腺苷（cAMP）^[6]首先是在六十年代，由Sohterland等人发现。AC酶能够将细胞外部的刺激传递到细胞内部，并发出信号，进而催化ATP生成cAMP，同时生成焦磷酸。cAMP参与多种代谢反应如促进脂肪水解产生ATP供能、调节血糖平衡等。它大量存在于生物机体内，调节生物机体的功能，因而受到科学家的重视。临床研究表明，cAMP可用来治疗多种疾病，例如糖尿病、高血压等，由此开发以cAMP为基础的药物治疗这些疾病^[7-8]。也可以把cAMP应用于畜牧业生产，提高幼畜基础代谢，抗病寒能力，减少幼畜越冬的死亡率，提高经济效益。用于成年家畜的增肥，可以缩短培育周期 ^[9]。合成cAMP的方法主要是化学合成法,可分为七种方法，大部分是以5'-AMP 为起始原料，加以不同的有机试剂( 如二环己基碳二亚胺DCC、2，2'-吡啶基二硫化物等^[10-11])，同时用到大量无水吡啶作为为溶解剂^[12-13]。化学合成法使用吡啶量大，不仅会影响工人的身体健康，还对环境造成污染。采用发酵法生产cAMP，代表菌种有节杆菌^[14]、酵母菌^[15]和枯草芽孢杆菌。据报道节杆菌cAMP 的产量≥7.23g /L，枯草芽孢杆菌大约6～7g /L。微生物发酵法反应周期短、产物纯度高，但还需要进一步改造菌株、完善发酵工艺，从而降低成本和提高产量，其生产过程也易受影响。所以可采取酶法，利用腺苷酸环化酶催化ATP生产cAMP^[16]

1.3载体材料的简介

在固定化酶体系中，载体材料的选择至关重要，因为固定化酶的活力、稳

定性和重复使用性是由载体材料的结构和性质直接决定的。载体材料的选择直接决定了固定化能否成功。因此，选择用于固定化酶的载体材料应该得到足够的重视。在固定化过程中，必须保证酶蛋白结构不因为固定到载体变形从而影响了活性。

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