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摘 要

生物膜是自然界中微生物群落的一种形态。微生物聚在一起，同时分泌有机物，如多糖群落的结构能够使其更好的适应外界的环境，抵抗那些不利于生存的因素。而在医学领域，由于致病菌经常形成生物膜使得菌体的耐药性一直提高。在工业发酵的技术应用领域，生物膜形成以及介质表面性质对影响细胞固定化的研究方面相对较少。特别是从细胞固定化及膜载体优化的角度解释固定化细胞发酵特征。巴斯德毕赤酵母作为甲醇营养型酵母，在工业企业生产当中，已经有很多种蛋白质已经被成功在毕赤酵母中表达，但是却很粘稠，最终不利用产物的分离，菌体也容易老化。

目前，细胞固定化的方法主要有：包埋法、吸附法、交联法等。细胞固定化操作便捷易懂，还不会改变菌株的形态，只要选择合适的吸附介质，依靠静电力、疏水力等弱相互作用力与细胞相互作用，就能使细胞吸附达到平衡的动态过程，发酵效率高于游离菌。

本课题主要针对生物膜在发酵生产中高性能的特征，探究其内在机理及优化固定化载体，尝试分别它们之间的界面相互作用机制，从解析获得的促发因素细胞和具有诱导结构的吸附功能的吸附材料相互作用机制的尝试和表面特征进一步提高固定化的发酵性能。

关键词：酵母细胞 介质改性 筛选

Screening and optimization of immobilized media for Pichia pastoris

Abstract

Biofilm is a form of microbial community in nature. In the field of medicine, due to the pathogenic bacteria often form inter organism. However, in the field of industrial fermentation, there are few studies on the effects of biofilm formation and medium surface properties on cell immobilization.The fermentation characteristics of immobilized cells were explained in terms of cell immobilization and membrane carrier optimization. However, it is also very viscous in industrial production, and the bacteria are easy to age without the separation of products. For the immobilized cell fermentation of Pichia pastoris, as long as the appropriate adsorption medium is selected, the operation is simple, and the morphology of the strain will not change, mainly relying on some relatively weak interaction forces such as electrostatic force, hydrophobic force and so on, so as to achieve a balanced dynamic process of cell adsorption The fermentation efficiency was higher than that of free.

In this paper, the high performance of biofilm in fermentation was studied, and the internal mechanism of biofilm and its application in fermentation were discussed and Optimize the immobilized carrier medium, study how to separate the interface mechanism between them, and explore its promoting role factors of cell self adsorption and the material structure and surface characteristics with adsorption induction function to further strengthen the performance of immobilized fermentation.

Key Words: Yeast cell ;Medium modification;Screen

目录

摘要 2

Abstract III

第一章 文献综述 1

1.1前言 1

1.2毕赤酵母表达系统的优点、存在问题及前景 1

1.3细胞固定化介质 2

1.4介质改性 3

1.4.1亲水性改造 3

1.4.2介质本体改性 3

1.4.3介质表面改性 4

1.4.4电负性改造 4

1.5 课题来源及研究内容 4

第二章 实验结果与讨论 6

2.1菌株 6

2.2主要实验试剂 6

2.3 主要实验仪器 7

2.4 培养基 8

2.5初筛 9

2.5.1测酶活性 9

2.6 载体改性（亲水、电负性） 10

2.7 发酵验证 10

第三章 结论与讨论 11

3.1初筛结果分析 11

3.2 二次筛选结果分析 11

3.3载体改性 12

3.4发酵验证 13

3.5实验小结 14

第四章结果与展望 15

参考文献 16

致谢 18

文献综述

1.1前言

毕赤酵母( Pichiapastoris) 是单细胞真核生物，它生长所需的碳源只有甲醇，具有菌株和载体^[1]。毕赤酵母表达系统的优势主要在于表达蛋白质方面，比如，它有着稳定的外源基因遗传^[2]的特点，可以很有效的完各种翻译后加工的工作，属于当前较受欢迎，为人研究应用最多的真核表达系统^[3]。这些年，美国FDA认和医药方面的应用为它打开了道路^[4]。比如，成功表达了融合蛋白M-IL-288Ar白细胞介素-II、C型溶菌酶Lyzl6等^[5]，还有在食品酶制剂领域的果糖酶^[6]等，其中有不少产品早已成功实现了商品化和产业化。近几年，毕赤酵母还被广泛应用于禽抗菌肽的表达研究也得到了极为充分的发挥。

毕赤酵母表达系统是当前流行的真核表达系统之一^[7]，毕赤酵母的表达成功性虽然也不是通用的，已经证明的确实可以表达不少颇具价值的蛋白，但仍旧有一些蛋白产量会极地或者干脆无法表达。不过确实也具有很多其他表达系统所不具备的优点，比如表达方式多样，产量高，还具有稳定性，操作简便等。

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