论文总字数：19182字

摘 要

胞苷酸是一种非常重要的核苷酸产品，经常被运用于许多不同的领域，如：食品添加剂、药物原料及前体等。

由于传统的胞苷酸生产方法存在后续分离纯化过程繁琐，操作条件苛刻以及非环境友好等不足。故寻找一种过程简便且绿色环保的胞苷酸生产方法就显得尤为重要。本课题所采用的是酶催化法制备胞苷酸，将尿苷激酶和乙酸激酶固定在载体上，催化底物胞苷生成胞苷酸。其中，本课题采用的亲和固定化方法，可以一步实现蛋白质的纯化和固定，大大缩短了固定化步骤，而双酶体系的思想则使胞苷酸的生成耦合了ATP的循环再生，可以减少ATP的使用从而达到节约成本的目的。

经实验，我们得到的固定化酶的相对酶活为50.4%，稳定性相较于游离酶提高了20%。这为今后固定化酶的生产提供了一个很好的思路。

关键词：固定化酶 胞苷酸 乙酸激酶 尿苷激酶

Immobilized Enzymatic Production of Cytidine monophosphates

Abstract

Cytidine monophosphates a very important nucleotide product, which is often used in many different fields, such as food additives, pharmaceutical raw materials and precursors.

The traditional production method of cytidine monophosphates has some shortcoming, such as the following separation and purification process is cumbersome, the operation conditions are harsh, and the environment is not friendly. Therefore, it is very important to find a simple and environmental friendly production method of cytidine monophosphates. In this paper, the enzyme catalysis method is used to prepare cytidine monophosphates. The uridine kinase and acetate kinase are fixed on the carrier, and the cytidine is combined to generate cytidine monophosphates. Among them, the affinity immobilization method adopted in this project can realize protein purification and immobilization step by step, greatly shortening the immobilization step, while the idea of double enzyme system makes the production of cytidine monophosphates coupled with the cyclic regeneration of ATP, which can reduce the use of ATP and save the cost.

The relative enzyme activity of the immobilized enzyme is 50.4%. The stability was improved by 20% compared with free enzyme. This provides a good idea for the production of immobilized enzyme in the future.

Keywords: Immobilized enzyme; Cytidine monophosphate; Acetate kinase; Uridine kinase

目录

摘要 I

Abstract II

目录 I

第一章 文献综述 1

1.1 胞苷酸及其衍生物的概述 1

1.2 胞苷酸的生产途径 1

1.3 尿苷激酶（UDK）和乙酸激酶（ACK）的概述 2

1.3.1 尿苷激酶（UDK） 2

1.3.2 乙酸激酶（ACK） 2

1.4 酶的固定化方法 3

1.4.1 酶的传统固定化方法 3

1.4.2 亲和固定化方法 3

1.5 亲和固定化载体的选择 4

1.6 琼脂糖的概述 5

1.7 研究内容 5

第二章 材料与方法 7

2.1 主要实验试剂 7

2.2 主要实验器材 8

2.3 溶液配制 8

2.4 载体的制备 9

2.5 细胞破碎 9

2.6 酶的固定 10

2.7 酶活测试 10

2.8 双酶体系酶最适反应比例 11

2.9 测定固定化酶热的稳定性（33℃） 11

2.10 25℃固定条件对的酶活性的影响 11

2.11 酶对固定化酶催化活性的影响 12

2.12 ATP浓度对固定化酶、游离酶催化活性的影响 12

2.13 研究ADP对固定化酶、游离酶催化活性的影响 12

第三章 实验结果 13

3.1 载体表征 13

3.1.1 氮气吸脱附曲线 13

3.1.2 热失重分析 14

3.2 双酶体系最适配比 14

3.3 固定化酶的性质 15

3.3.1 固定化酶的催化活性 15

3.3.2固定化酶的热稳定性 17

3.4 影响固定化酶催化活性的因素 18

3.4.1 温度对固定化酶催化活性的影响℃ 18

3.4.2 固定比例对固定化酶催化活性的影响 18

3.4.3 ATP、ADP对固定化酶催化活性的影响 19

第四章 结论与展望 21

4.1 结论 21

4.2 展望 21

参考文献 22

致谢 25

第一章 文献综述

1.1 胞苷酸及其衍生物的概述

胞苷酸（5’-cytidine monophosphate，CMP）是生物细胞内重要的生化物质并参与多种生理生化反应^[1]。其分子式为C₉H₁₄N₃O₈P，分子量为323.21，常温下为无色至白色结晶^[2]。可溶于水（67%，20℃），几乎不溶于乙醇等有机溶剂^[3]。其结构如图1-1所示。

图1-1 5’-胞苷酸的结构图

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