论文总字数：22325字

摘 要

大肠杆菌是一种使用微生物发酵法生产L-苏氨酸的主要微生物，而如何在大肠杆菌的工业化生产中利用生物膜固定化发酵系统则是当前生物膜固定化发酵进一步发展和研究的重心和难点。本次实验中，利用E.coli W1688菌，通过过表达和敲除AI-2群体感应关键基因lsrB这一调控大肠杆菌生物膜的重要基因，以其菌株的成膜情况和发酵产物L-苏氨酸的产量作为判断标准，探究lsrB基因对于大肠杆菌生物膜固定化发酵的影响。针对这两个判断标准，我们首先使用结晶紫染色法验证菌株成膜情况，然后通过固定化发酵培养来验证L-苏氨酸的产量变化。

结晶紫染色法的结果显示，过表达lsrB基因的E.coli W1688-lsrB^*菌株的生物膜在LB培养基中的相对表达提高了83.3%，而敲除该基因后，E.coli W1688-ΔlsrB菌株的生物膜相对表达则下降了25%。实验结果表明，过表达lsrB基因的E.coli W1688-lsrB^*菌株的L-苏氨酸产量上升了44.2%，而敲除该基因时的E.coli W1688-ΔlsrB菌株的L-苏氨酸产量则下降了7.6%。

上述实验结果，证实了对于lsrB基因的改造可以有效的影响大肠杆菌L-苏氨酸的产量与菌株的成膜情况。在过表达lsrB基因时，对于L-苏氨酸的产量和生物膜相对表达的影响尤为明显，均出现了显著的上升。

关键词：大肠杆菌 lsrB 固定化发酵 L-苏氨酸

Abstract

E.coli is a major microorganism for producing L-threonine by microbial fermentation. How to use biofilm immobilized fermentation system in the industrial production of E. coli is the big problem of the further development and research of biofilm immobilized fermentation. In this experiment, the key gene lsrB of the AI-2 quorum sensing system was used to overexpress and knock out in the E.coli W1688 strain, which is also an important gene regulating E. coli biofilm. Using the biofilm-forming ability and the yield of its fermentation product L-threonine of the strain as the judgment criteria, the effect of lsrB gene on the immobilization fermentation of E. coli biofilm was explored. In response to these two judgment criteria, we first used the crystal violet staining method to verify the membrane formation of the strain,and then verified the change in the production of L-threonine by fermentation.

The consequence of crystal violet staining confirmed that the relative expression of the biofilm of E.coli W1688-lsrB^* strain overexpressing the lsrB gene in LB medium increased by 83.3%, and after knocking out the gene, the relative expression of the biofilm of E.coli W1688-ΔlsrB strain decreased by 25%.The results of the experiment showed that in the fermentation experiment, the L-threonine production of the E.coli W1688-lsrB^* strain increased by 44.2%, while the L-threonine production of the E.coli W1688-ΔlsrB strain fell by 7.6%.

The above experimental results confirmed that the modification of the lsrB gene can effectively affect the production of L-threonine and the biofilm formation of the strain. When overexpressing the lsrB gene, the effects on the production of L-threonine and the relative expression of biofilms are particularly obvious, and both have a significant increase.

Keywords: E. coli；lsrB；biofilm immobilized fermentation；L-threonine

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1 生物膜 1

1.1.1 生物膜概述 1

1.1.2 生物膜的成分及结构 1

1.1.3 形成生物膜的过程 2

1.1.4 生物膜的应用 3

1.2 关键基因及AI-2群体感应系统 4

1.2.1 E.coli生物膜形成的关键基因 4

1.2.2 AI-2群体感应系统 4

1.2.3 AI-2群体感应的关键基因lsrB 4

1.3 L-苏氨酸 5

1.4 研究内容 5

第二章 实验部分 7

2.1 药品与仪器 7

2.1.1 实验仪器 7

2.1.2 药品 8

2.1.3 培养基及缓冲液 9

2.2 目的菌株的分子改造 11

2.2.1 实验菌株 11

2.2.2 lsrB基因的过表达 11

2.3 生物膜表达量研究 15

2.4 目的菌株发酵产L-苏氨酸性能研究 15

2.4.1 活化和接发酵液 15

2.4.2 测定葡萄糖含量 16

2.4.3 L-苏氨酸产量测定 16

第三章 结果与讨论 17

3.1 E.coli W1688-ΔlsrB的电泳结果 17

3.2 目的菌株分子改造电泳结果 17

3.2.1 大肠杆菌W1688基因组的提取 17

3.2.2 lsrB目的基因的扩增 18

3.2.3 载体的线性化 18

3.2.4 重组质粒的构建 19

3.2.5 E.coli W1688-lsrB^*菌落PCR验证 19

3.3 E. coli W1688、E. coli W1688-lsrB*和 E. coli W1688-ΔlsrB 生物 20

膜相对表达的对比 20

3.4 E. coli W1688、E. coli W1688-lsrB*和 E. coli W1688-ΔlsrB发酵产苏氨酸性能的对比 21

第四章 结论与展望 23

4.1 结论 23

4.2 展望 23

参考文献 24

致谢 28

第一章 绪论

1.1 生物膜

1.1.1 生物膜概述

生物膜（Biofilm）是一种联结细胞和细胞或非生物表面的复杂细胞群落^[1]。生物膜具有特殊的结构，由形状如塔和蘑菇一般的小菌落构成，并由细胞外基质组成了这个复杂的生物聚集体^[2-4]。自然界里，能够形成生物膜的微生物足有90%，这些微生物普遍具有较强的耐受性与抗逆性，即使在极端的环境下，依旧可以生存，哪怕是营养匮乏，也能完成生存繁殖的使命。第一次发现生物膜的存在，是荷兰科学家Antony van Leeuwenhoek在1683年通过自制显微镜观察并描述了牙菌斑中的细菌时发现的^[5]。生物膜的理论是由科学家Costerton在1978年提出，而直到1991年，细菌生物的三维结构才由加拿大科学家John R. Lawrence提出^[3]。医学领域中，生物膜已被证明与各种各样的医疗器械关联而导致各种疾病的产生于感染，因此研究生物膜产生的机制和控制生物膜感染的方法以达到治疗疾病的效果是现阶段医学研究的重点^[1]。近些年，在深入研究生物膜感染细胞的机制，发现生物膜在工业化生产中固定化细胞的作用愈发重要，因此在国内外学者眼中，细菌生物膜相关的研究也变得愈发重要。

1.1.2 生物膜的成分及结构

微生物生物膜的主要成分是微生物在生长过程中分泌细胞外的基质，这些分泌物能覆盖在细胞的表面，将细胞与细胞之间以及细胞与非生物表面形成一个整体^[7]。大自然中有众多的微生物，因此生物膜的结构和组分也有所差异，这也增加了生物膜的多样性。通过实验研究，生物膜具有复杂且有组织性的微生物聚集效应，而生物膜中的成分，如水、胞外多糖（甘露聚糖、葡聚糖等）、eDNA、蛋白质、脂质和酶等物质都在其中发挥不同的作用，生物膜蕴含着复杂的传导形成系统和信号感应系统^[8-10]。这些物质的存在增加了细胞与细胞之间的聚集，而胞外多糖的存在也增加了细胞之间的黏附并且维持生物膜的形态稳定^[11]。

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