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摘 要

Prm1（pheromone-regulated membrane protein 1）是一个受信息素诱导表达的四次跨膜蛋白，在酿酒酵母细胞融合中起到重要作用，但具体作用机制尚不清楚。目前鲜见对Prm1表达纯化相关研究。本课题选择常用原核表达载体pET29a( )，利用E.coli BL21构建Prm1表达菌株，尝试对其理化性质进行表征。SDS-PAGE结果显示，在全细胞裂解液上清中出现Prm1条带。后续将从温度、诱导剂浓度、诱导时间等方面对诱导条件进行优化。本课题对Prm1结构的解析及其在酵母细胞融合中作用机制的研究奠定基础。

关键词：Prm1 大肠杆菌表达系统 异源表达

Construction and Expression of Prm1-pET29a in E coli

Abstract

As a pheromone-induced protein with four putative transmembrane domains, Prm1 (pheromone-regulated membrane protein 1) plays an important role in the fusion of Saccharomyces cerevisiae. But the specific mechanism is still unclear. At present, no study related to the expression and purification of Prm1 has been conducted. This study aims at characterizing the physical and chemical peoperties of Prm1. The commonly used prokaryotic expression vector pET29a( ) was selected to express in E.coli BL21. SDS-PAGE results show that corresponding band of Prm1 appeared in the supernatant of whole cell lysate. Subsequently, the induction conditions will be optimized in temperature, induction time and the concentration of inducer to improve the production of Prm1. This study lays a foundation for the further research on the structure of Prm1 helps to reveal its specific mechanism in yeast cell fusion.

KEY WORDS: Prm1; Escherichia coli expression system; Heterologous expression

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 细胞融合机制 1

1.1.1 酵母细胞的融合 1

1.2 融合蛋白 2

1.2.1 质膜融合过程相关蛋白-Prm1 2

1.3 Prm1的关键基因-Prm1 3

1.3.1 Prm1基因的表达机制 3

1.4 大肠杆菌蛋白表达机制 3

1.5 研究背景和手段 4

第二章 实验材料 5

2.1 实验材料 5

2.1.1 生物信息学方法 7

2.1.2 主要溶液成分与培养基 7

第三章 实验方法 9

3.1 质粒pET29a转化E.coli DH5α 9

3.1.1 接种pET29a到LB培养基 9

3.2.1 基因法纯化质粒pET29a 10

3.3 BY4741酵母菌的培养 10

3.4 一步克隆 11

3.4.1 Prm1基因组的获取和扩增 11

3.4.2 重组质粒Prm1-pET29a的构建与验证 12

3.4.3 酶切产物的连接 13

3.4.4 重组DNA产物的转化 14

3.4.5 一步克隆产物验证 14

3.5 重组质粒Prm1-pET29a-4转化BL21 15

3.5.1 接种Prm1-pET29a-BL21到液体培养基 15

3.5.2 提取Prm1-pET29a-BL21质粒 15

3.5.3 双酶切验证质粒 15

3.6 诱导Prm1表达 16

3.6.1 超声破壁菌体 16

3.6.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 17

第四章 实验结果 18

4.1酿酒酵母基因组的提取 18

4.1.1 Prm1基因片段的获取与扩增 18

4.2 目的基因及质粒酶切电泳结果 19

4.3 验证一步克隆产物 20

4.4 Prm1-pET29a-BL21的验证 20

4.5 Prm1-pET29a-BL21的诱导表达 21

第五章 结论与展望 23

参考文献 24

致谢 27

第一章 文献综述

1.1 细胞融合机制

细胞融合是指两种不同基因型的细胞或原生质体在自然或人工诱导的条件下相互融合形成杂交细胞^[1]。细胞融合之前，两两细胞膜之间的特征距离由特定细胞的粘接蛋白质控制。膜蛋白移向融合位点的外围后，膜双层开始相互靠近到非常近的距离，这个过程克服了与水合力或热波动有关强烈排斥的相互作用^[2]。膜双层因靠近而产生的强烈弯曲的使它们在几纳米内立即接触，并促进脂质单层的局部破坏和重排。许多融合过程的路径始于半融合，即融合双层的单层之间的合并^[3]，半融合结构中融合孔的开放允许细胞质内容物的混合，从而允许脂质标记在细胞之间重新分布，孔的扩展将两个细胞结合成一个，细胞完成融合^[4]。

在分子生物学层面上看，细胞融合打破了仅仅依赖有性重组基因和杂交手段来发掘新物种这一屏障。细胞融合技术可有效地避免基因操纵技术，如分离、纯化、剪切、组装等，是改造细胞遗传物质的有力手段^[5]。

1.1.1 酵母细胞的融合

酵母特别是酿酒酵母细胞融合的具体步骤是：当酵母在某个阶段生长时，当两个配型不同的细胞（a和α）相互接近并彼此接触时^[6]，两个细胞的小突起各自延伸，当细胞壁在接触时溶解时，然后两两单倍体的细胞核相互融合，细胞融合后会汇聚成为一个二倍体^[7]。

在多种酵母细胞融合的相关研究中，酿酒酵母有性生殖的融合过程已得到较为详细的描述^[8]。酿酒酵母中的融合是通过核融合的相反交配型的单倍体细胞的融合，从而形成二倍体，这个二倍体是能够营养生长的细胞萌芽^[4]。二倍体的形成过程是由信息素介导的。两种交配类型的酵母，a型和α型。当信息素与相反配型细胞表面受体结合时，受到交配信息素刺激的细胞会产生表面凝集素，将其细胞周期阻滞在G1阶段，并伸长形成可辨别的尖端^[9]。当两个细胞接触后会迅速开始相互作用，发生细胞壁的降解或重构以及两个质膜的融合^[10]。细胞核随后在该哑铃状合子内融合，并且所产生的二倍体核开始一系列的分裂循环，每个分裂循环产生一个新的二倍体小核，该小核进入一个渐生的芽，完成融合^[11]。

1.2 融合蛋白

融合蛋白是介导两个细胞质膜融合的一组蛋白，参与融合反应的蛋白质通常以多聚体的形式存在^[12]。将蛋白鉴定为融合蛋白的黄金标准是：（1）该蛋白是融合所必需的；（2）在正确的时间和地点出现在融合膜上；（3）该蛋白使通常不融合的膜发生融合。细胞融合过程是由必需的融合蛋白通过多种机制来实现的^[13]。

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