论文总字数：18443字

摘 要

Serrwettin是由Serratia marcescens所产的一种脂肽类生物表面活性剂。根据结构不同，可分为serrawettin W1，serrawettin W2，serrawettin W3，分别能将水的表面张力降低至32.2 mN/m、33.9 mN/m和28.8 mN/m。其中serrawettin W1通常与灵菌红素伴生。与化学表面活性剂相比，serrawettin作为生物表面活性剂具有低毒，对环境友好等特点，在微生物采油和环境修复等领域具有潜在应用前景。

本论文使用的是从石油污染土壤中筛选获得了一株能够产生物表面活性剂的革兰氏阴性细菌，鉴定为Serratia marcescens。经验证，其所产生物表面活性剂为serrawettin，本文针对Serratia marcescens的生长条件及serrawettin的基本特性展开研究，利用测定表面张力，乳化指数（EI24） 等参数来确定serrawettin作为生物表面活性剂的特性。结果表明：菌株最适碳源为甘油，最适氮源为尿素，最适生长条件为30℃，pH 7，10g/LNaCl；serrawettin粗品的CMC值为500mg/L，能够将水的表面张力降低至30左右，对短链烷烃，环己烷，二甲苯等乳化效果较好，所能耐受温度及pH的范围较广。

本研究主要对serrawettin的基本性质作了初步表征，对于其进一步应用于石油工业奠定了基础。

关键词：Serratia marcescens serrawettin 生物表面活性剂 生物修复

Study on the surfactant serrawettin produced by Serratia marcescens

Abstract

Serrwettin is a lipopeptide biosurfactant produced by Serratia marcescens. According to different structures, it can be divided into serrawettin W1, serrawettin W2, and serrawettin W3, which can reduce the surface tension of water to 32.2 mN/m, 33.9 mN/m, and 28.8 mN/m, respectively. Serrawettin W1 is usually associated with erythromycin. Compared with chemical surfactants, serrawettin has the characteristics of low toxicity and environmental friendliness as a biological surfactant, and has potential application prospects in the fields of microbial oil production and environmental remediation.
In this paper, a Gram-negative bacterium capable of producing surfactants was screened from petroleum contaminated soil and identified as Serratia marcescens. It has been verified that the surfactant produced by it is serrawettin. In this paper, we study the growth conditions of Serratia marcescens and the basic characteristics of serrawettin, and determine the characteristics of serrawettin as a biosurfactant by measuring surface tension, emulsification index (EI24) and other parameters . The results showed that the optimal carbon source of the strain was glycerin, the optimal nitrogen source was urea, and the optimal growth conditions were 30 ℃, pH 7, 10g/L NaCl; the CMC value of serrawettin crude product was 500mg/L, which could reduce the surface tension of water Up to about 30, it has a good emulsifying effect on short-chain alkanes, cyclohexane, xylene, etc. It can withstand a wide range of temperature and pH.
This study mainly made a preliminary characterization of the basic properties of serrawettin, and laid a foundation for its further application to the petroleum industry.

Keywords: Serratia marcescens serrawettin biosurfactant Bioremediation

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1石油污染现状 1

1.2石油污染修复技术 2

1.3微生物修复技术 3

1.4生物表面活性剂 3

1.5 Serratia marcescens与serrawettin简介 3

1.6 Serrawettin的应用 3

第二章 材料与方法 5

2.1实验材料 5

2.2实验方法 6

第三章 结果与讨论 8

3.1实验结果 8

第四章 结论 13

参考文献 26

致谢 28

第一章 文献综述

1.1石油污染现状

石油作为重要的工业原料，在能源，化工，材料等领域起着至关重要的作用。然而在石油开采，运输，储存的过程中，因非正常操作而导致石油泄露的事件时有发生^[1-2]。石油的意外泄漏不仅会对经济造成损失，而且会对环境造成极大的污染。2010年美国墨西哥湾漏油事件给造成了长200公里，宽100公里海域的海水污染^[3]。2016 年陕西长庆油田连续发生 3 次较为严重的石油泄漏事故，原油钻井过程、输送过程管线泄漏亦时有发生，对采7油区土壤造成严重污染^[4]。石油污染物组成复杂，其中所含的卤代烃，苯系物，多环芳烃等具有致癌，致畸，致突变的作用，其一旦进入土壤中，对人类健康和环境都会造成极大危害^[5]。因此，全球的石油污染的环境修复问题目前亟待突破。

1.2石油污染修复技术

目前，石油污染土壤的修复主要包括三类：物理修复，化学修复，以及微生物修复^[6]。与物理修复和化学修复相比，微生物修复具有成本低，降解效率高，不造成二次污染，不破坏土壤的结构组成等优点^[5,9-11],因此石油污染土壤的微生物修复技术是最适合我国国情的修复技术，也是未来最具有前景的修复技术。

1.3微生物修复技术

微生物修复是利用细菌或真菌将土壤中的石油烃降解转化成低毒或者无毒的小分子^[12]，目前，自然界中存在许多具有石油降解能力的细菌，例如Bacillus, Pseudomonas, Acinetobacter, Serratia marcescens等等，这些微生物不仅能够降解石油，同时还会合成生物表面活性剂或生物乳化剂。Zhang等从石油污染土壤中筛选获得了一株假单胞菌，能够以原油为唯一碳源生长，并且能够优先利用直链烷烃和多环芳烃^[13]。Ibrahim等获得了一株Serratia marcescens，以2ml/L原油作为唯一碳源时，原油降解率可达90%，并且能够高效合成脂肽类生物表面活性剂，具有良好的乳化活性和对温度，盐度，pH的稳定性^[14]。

1.4生物表面活性剂

生物表面活性剂是由微生物合成的次级代谢产物^[15]，根据产生菌，代谢底物，培养条件的不同，其可以分为脂肽，糖脂，脂肪酸等等^[14]。生物表面活性剂由于其分子结构中的疏水性和亲水性末端而具有两亲性质。这种两亲性质会导致其在两种不混溶的液体之间累积，降低两相之间的排斥力^[16]，并促进一种液体向另一种液体中的分散，从而形成两相乳液^[17]。通常，有效的表面活性剂将水和空气之间的表面张力从72降低到35 mN/m，将水和正十六烷之间的界面张力降低40至1 mN/m ^[15]。与化学表面活性剂相比，生物表面活性剂具有毒性低，可降解和环境友好的特点，并且可以耐受极端的pH，温度和盐度。

1.5 Serratia marcescens与serrawettin简介

粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens），革兰氏阴性，具周生鞭毛，能够产颜色鲜红的灵菌红素又称灵杆菌，因其具有原油降解能力而被广泛报道^[18]。此外，沙雷氏菌属可产种类丰富生物表面活性剂，如serrawettins、rubiwettins以及鼠李糖脂等。serrawettins是由粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）合成的脂肽类生物表面活性剂，具有典型的两亲性分子结构——亲水端由氨基酸或肽构成，亲油端由β-羟基脂肪酸构成。根据分子中氨基酸或肽组分的差异，serrawettins又可分为serrawettin W1、serrawettin W2和serrawettin W3。serrawettin W1是由L-Ser和β-羟基脂肪酸（C₈-C₁₄）构成的环状内酯，通常与灵菌红素伴生；serrawettin W2由五肽和β-羟基脂肪酸（C₈-C₁₀）构成的环状内酯；而serrawettin W3的结构和合成机制还未阐明。三种serrawettins均具有良好的表面活性，可分别降低水的表面张力至32.2 mN/m、33.9 mN/m和28.8 mN/m。serrawettins不仅具有抗细菌、抗真菌、抗线虫、抗肿瘤等生物学功效，还具有乳化活性、表面活性以及润湿活性等，在医药领域和石油工业具有广泛的应用前景^[19]。

1.6 Serrawettin的应用

1.6.1在医药领域应用

Serrawettins具有较好的抑菌作用，可以用于抗生素开发和生物防治。Heis等^[20]从 Serratia marcescens 2MH3-2菌株的发酵液中提取了serrawettin W2粗提物，研究显示其具有良好的抗菌活性。Dwivedi等^[21]纯化了serrawettin W1，并测定了其对分枝杆菌生长的影响，结果表明serrawettin W1对分枝杆菌均具有明显的抑制作用。Su等^[22]对 Serratia surfactantfaciens sp.nov. YD25^T所代谢合成serrawettin W2的抑菌活性进行了研究，结果表明serrawettin W2浓度达到30 μg/mL时，对模式菌株Staphylococcus aureus、Pseudomonas aeruginosa均具有抑制作用。Kadouri和 Shanks^[23]认为，尽管沙雷氏菌属所产的生物表面活性剂对多种菌株均表现了抑制作用，但是serrawettin W1在抑菌的同时还具有一定的细胞毒性，因此不能作为抗生素直接使用。

Serrawettins除抑菌活性之外，还具有抗癌活性。Tomas等^[24]研究了serrawettin W1的抗癌活性，发现serrawettin W1可降低多种癌细胞（Jurkat、Molt-4、NSO、 HGT-1、HT-29 、GLC-4S）的活性，具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，而对正常细胞没有影响。Su等^[22]发现serrawettin W2能够抑制癌细胞（HeLa和Caco-2）生长而表现出抗肿瘤的活性，其对正常细胞生长并无抑制作用。基于此，serrawettins具有开发成治疗白血病、淋巴癌等化疗药物的潜力。

1.6.2在石油工业的应用

表面活性剂在石油工业中应用非常广泛，与化学表面活性剂相比，生物表面活性剂所具有的低毒，对环境友好等特点，更加得到了人们的青睐^[25]。

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