论文总字数：22360字

摘 要

糖苷转移酶能够将活化的糖基供体的糖基团转移到小分子化合物上从而改变这些化合物的生物化学性质。它广泛分布在动物、植物和微生物中，在糖苷的合成中有非常重要的作用，但它参与催化反应时需要以昂贵的UDPG作为糖基供体。本研究采用数据挖掘的方式，挖掘了一种新型的葡萄糖苷转移酶。首先通过基因工程技术对其进行克隆表达，以莱鲍迪苷 A、甜菊糖苷、甜菊醇作为底物，测定活性，结果表明以莱鲍迪苷 A和甜菊糖苷为底物时有活性，活性分别为0.458mU/mL和0.389mU/mL,以甜菊醇为底物时没有活性。然后构建了糖苷转移酶和蔗糖合成酶的共表达体系，利用蔗糖合成酶催化价格低廉的蔗糖制造UDPG作为糖基供体，建立一种循环再生的辅酶体系以解决其参与催化反应时经济成本高的问题。

关键词：糖苷转移酶 甜菊糖 蔗糖合成酶 基因克隆 共表达

Cloning ,Expression and Characterization of Glycosyltransferases from Ziziphus jujuba

Abstract

Glycosyltransferases can change the biochemical properties of activated sugar donors by transferring their sugar groups to small molecules. It is widely distributed in animals, plants and microorganisms and plays an important role in the synthesis of glycosides, but it needs an expensive UDPG as a sugar-based donor for its catalytic reaction. In this study, a new type of Glucosyltransferase was mined by data mining. Firstly, it was cloned and expressed by gene engineering technology, and its activity was determined by using rebaudioside a, Stevioside and Steviol as substrates. The results showed that rebaudioside a and Stevioside as substrates had activity The bioactivities were 0.458 mu / mLand 0.389 mu / mL respectively. Steviol as substrate had no bioactivities. Then the co-expression system of glycosyltransferases and sucrose synthetase was constructed. UDPG was made from sucrose with low cost catalyzed by Sucrose Synthetase A recycling coenzyme system was established to solve the problem of high economic cost when it participates in catalytic reaction.

Key Words: Glycosyltransferase; Stevioside; Sucrose; Synthetase; Gene cloning; Coxpression;

目 录

摘 要 II

目 录 1

第一章 文献综述 3

1.1 甜菊糖苷简介 3

1.2 糖苷转移酶简介 4

1.3 糖苷转移酶的家族分类 4

1.4 糖苷转移酶的应用 5

1.5 辅酶再生系统 6

1.6 酶的共表达 6

1.7 本课题研究目的和意义 6

第二章 材料与方法 8

2.1 实验材料 8

2.1.1 实验仪器 8

2.1.2 实验试剂 9

2.1.3 菌株与质粒 9

2.1.4 培养基及培养条件 10

1.培养基 10

2.菌种保藏、活化和培养条件 10

2.2 实验方法 11

2.2.1 糖苷转移酶基因在Escherichia coli中的克隆和表达 11

1. 糖苷转移酶基因合成 11

2. 糖苷转移酶的诱导表达 11

3. 制备粗酶液 11

2.2.2 甜菊糖苷类底物的活性测定 11

2.2.3 糖苷转移酶与蔗糖合成酶的共表达 12

第三章 结果与讨论 14

3.1 糖苷转移酶基因在Escherichia coli中的克隆和表达 14

3.2 Ziziphus jujuba的糖苷转移酶特异性 14

3.3糖苷转移酶与蔗糖合成酶的共表达 16

3.2.1 蔗糖合成酶的PCR扩增 16

3.2.2 糖苷转移酶与蔗糖合成酶双基因表达质粒重组构建 16

3.2.3 糖苷转移酶与蔗糖合成酶双酶共表达的SDS-PAGE 分析 17

3.2.4 酶催化合成莱鲍迪苷 D 18

第四章 结论与展望 19

4.1 结论 19

4.2 展望 19

参考文献 20

文献综述

甜菊糖苷简介

甜菊糖苷是一种天然甜味剂，可广泛应用于食品、汽水、医药和日用化学品中[1]。 它是一种很好的膳食补充剂，无热量，热稳定性和无毒性，具有糖一样的味道，适用于糖尿病和苯丙酮尿症患者和肥胖者， 它也是不发酵的，具有抗癌、抗氧化、抗高血糖、抗高血压、抗腹泻、抗炎和抗癌等特性。甜菊糖苷是二萜衍生物甜菊醇的一个糖苷。 甜菊叶中含有8种不同的甜菊醇糖苷，主要成分为甜菊糖苷 ，在干叶中约占5-10% 。 其他主要成分是莱鲍迪苷a 、 莱鲍迪苷 b，莱鲍迪苷 c、莱鲍迪苷d、甜菊糖苷 a、红莓苷[2]。 莱鲍迪苷b、莱鲍迪苷c、莱鲍迪苷d是从甜菊叶中分离得到的次要成分，这些化合物是二萜甜菊醇[2]。莱鲍迪苷b尝起来比蔗糖甜150倍;莱鲍迪苷c尝起来比蔗糖甜20-30倍;瑞鲍迪甙d尝起来比蔗糖甜200-220倍;甜菊糖甙的甜味效力是蔗糖的250-300倍，所有这些都是无热量的。

表 1-1 甜叶菊中各糖甙的含量和味质特性

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