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摘 要

酯酶广泛存在动物、植物、微生物中，且微生物 中细菌、真菌和酵母中的酯酶含量较为丰富，因此微生物发酵是酯酶的主要来源。

深海微生物因为海洋特殊的物理、化学因素的复杂性，造就了生命活动的复杂性，物种资源、基因功能和生态功能上的生物多样性。因为条件限制，所以我们对其研究很少。

使用三丁酸甘油酯筛选平板法，从实验室菌库的海洋细菌中筛选出能产生透明圈的菌株，即产酯酶细菌菌株。总共筛选出了10株产酯酶菌株，通过复筛确定其中2号菌水解活性最高，将这些产酯酶细菌放置在37 ℃恒温摇床培养后，进行菌株的甘油保藏和总DNA抽取。把从菌液中提取的基因组DNA进行16S rRNA鉴定与PCR扩增，送测后将得到的基因序列对比，初步确定2号菌为蜡状芽孢杆菌。

关键词： 海洋菌 酯酶 深海淤泥 PCR扩增

Screening and identification of esterase-producing bacteria

Abstract

Esterases are widely found in animals, plants, and microorganisms, and the esterases in bacteria, fungi, and yeast are abundant in microorganisms. Therefore, microbial fermentation is the main source of esterase. Esterases are widely found in animals, plants, and microorganisms, and the esterases in bacteria, fungi, and yeast are abundant in microorganisms. Therefore, microbial fermentation is the main source of esterase.

Due to the complexity of the special physical and chemical factors of the ocean, deep-sea microbes create the complexity of life activities, the biodiversity of species resources, gene functions and ecological functions. Because of the limited conditions, we have little research on it.

Using the tributyrin screening method, a strain capable of producing a transparent circle, that is, an esterase-producing strain, was selected from marine bacteria in the laboratory bacteria bank. A total of 10 strains of esterase-producing strains were screened, and the hydrolysis activity of the No. 2 strain was determined by rescreening. The esterase-producing bacteria were placed in a 37 °C constant temperature shaker for glycerol preservation and total DNA extraction. The genomic DNA extracted from the bacterial liquid was subjected to 16S rRNA identification and PCR amplification, and the obtained gene sequence was compared after the test, and the No. 2 strain was initially determined to be Bacillus cereus.

Keywords: Marine Fungus；ESTERASE；Deep sea mud；PCR amplification

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1酯酶的概念 1

1.2酯酶与脂肪酶的差异 1

1.3 产酯酶菌株的筛选 2

1.4微生物酯酶的发酵工艺 2

1.5酯酶在食品加工中的应用 3

1.6酯酶在医药行业中的应用 3

1.7酯酶在环保行业的应用 4

1.8酯酶在洗涤工业中的应用 4

1.9课题研究内容 5

第二章 实验材料与方法 6

2.1材料 6

2.1.1实验材料 6

2.1.2培养基的配置 6

2.1.3培养基的制备 6

2.1.4实验仪器 7

2.1.5实验药品 7

2.2实验方法 8

2.2.1菌种的保藏 8

2.2.2酯酶的筛选 9

2.2.3 16S rRNA鉴定 10

第三章 结果与分析 13

3.1筛选结果 13

3.1.1菌种活化 13

3.1.2酯酶的初筛 14

3.1.3酯酶的复筛 15

3.2凝胶电泳分析 16

3.2.1总DNA基因组提取的凝胶电泳 16

3.2.2 PCR扩增产物凝胶电泳成像 17

3.316S rRNA鉴定结果 18

3.4形态学鉴定 18

3.5生理生化鉴定 20

第四章 结论与展望 21

参考文献 22

致 谢 24

第一章 文献综述

1.1酯酶的概念

酯酶是一类既可催化酯键水解又可催化酯键合成的酶的总称，其催化酯键水时，使酯键断裂，产物为醇和酸，催化酯键合成时，使酸的羧基和醇的羟基脱水缩合，产物为酯类及其他香味物质，酯酶广泛存在动物、植物、微生物中，且微生物 中细菌、真菌和酵母中的酯酶含量较为丰富^[1]。因此微生物发酵是酯酶的主要来源，由于微生物种类多、繁殖快，具有比动植物更广的作用pH、作用温度以及底物专一性、便于工业生产等优点，故微生物发酵酯酶得到了研究人员的关注，并且已经将其广泛应用于食品加工、医药化学品、洗涤行业和环境保护等领域^[1]。除此之外，酯酶的酶促反应具有较高的底物专一性、区域选择性或者对映选择性，酯酶是合成手性化合物（如手性药物、农药等）的高效生物催化剂，近年来微生物发酵的酯酶已成为研究热点，本文从酯酶的来源、产酯酶菌株的筛选以及菌种的鉴定进行了综述，以期今后对酯酶的研究提供有益的借鉴^[1]。

1.2酯酶与脂肪酶的差异

微生物酯酶和微生物脂肪酶的定义和分类在文献报道中并没有加以严格区分，但实际上还是存在一些差异：①酯酶与脂肪酶的差异主要在于作用底物碳链长短的不同，脂肪酶优先水解长链酯类，酯酶则优先水解短链酯类^[2]。对于酯分子的酯酶和脂肪酶水解，酯化物作用于I型酯，脂肪酶作用于II型酯（如下图），对于由较大基团的手性羧酸和较小基团的醇形成的酯，其水解或酯交换选择酯酶催化较为适宜，而对于由较小基团的羧酸和较大基团的手性醇形成的酯，进行水解和转酯化反应时则选择脂肪酶催化较为适宜^[2]。②两者作用底物的物理状态不同，即脂肪酶主要在两相体系（油-水界面）上作用，而酯酶只作用于水溶性的底物或者只能分解已溶解的底物^[3]。③脂肪酶的催化剂反应具有界面活化的现象，酯酶的反应遵循经典的米氏动力学过程，酯酶和脂肪酶都能稳定存在于有机溶剂中并表现出活性，但脂肪酶的这一特征更为突出^[3]。④虽然酯酶和脂肪酶结构大多都是 a / b 的水解酶的典型特征，但是脂肪酶存在一个疏水的盖子结构，对催化反应有一定的选择性^[4]。

1.3 产酯酶菌株的筛选

产酯酶菌种的筛选一般有两个步骤：初筛和复筛。初筛多是采用平板培养透明圈法，一般是将筛选到的菌种进行富集，然后用无菌水稀释，涂布在含有酯酶的合适底物的平板上，通过培养一段时间后，平板上菌落周围会形成透明水解圈，并根据透明圈的大小初筛合适的菌种^[5]。Guillermo等利用透明圈变色法来筛选产酯酶的菌种，相比较传统的筛选方法，筛选结果更为清晰可见，变色透明圈更为直观，复筛是将初筛得到的产酯酶能力较强的菌株移入三角瓶内振荡培养，然后通过较为精确的荧光比色法（乙酸萘酯或对硝基苯酚检测法）对产物进行分析检定，从中找出产酶量最高、性能上更符合要求的菌株^[5]。

1.4微生物酯酶的发酵工艺

微生物酯酶的发酵工艺常见的有固体发酵生产和液体深层培养生产两种。

微生物酯酶的固体发酵生产是指微生物在不含流动水的有一定湿度的水不溶性固态基质上进行生长和代谢的培养过程，一般说来，固体培养方式主要应用于微生物酯酶菌种和孢子的培养和保存，其优点是发酵空间经济、发酵培养基简单、不需要复杂的机械设备和控制系统、耗能低、生产成本小等，缺点是容易污染^[6]。李佐华、吴衍庸利用红曲霉、根霉和球拟酵母等固态发酵产生的酯酶，可以提高浓香型曲酒中酯的含量，同时也可以提高曲酒的香味和口感^[6]。腾巍等为了提高大曲中乙酸乙酯的含量，从汾酒大曲中分离得到1株高产乙酸乙酯酯化酶的霉菌SXG-Z-6，对该菌体采用固体发酵培养，结果酯化力高达615.8 mg/dL，比传统培养提高了35.7%^[7]。

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