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摘 要

解脂耶氏酵母被认为是用于聚酮化合物生产的理想菌株，由于其细胞内隐含高含量的乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A。本研究着眼于具有独特的柠檬酸穿梭途径，能够生成大量的丙二酰辅酶A的解脂耶氏酵母，期望通过合成生物学方法的开发，创建间苯三酚的微生物优产系统。本研究以聚酮化合物间苯三酚的生物合成为研究对象，利用最新兴起的合成生物学技术手段，期望在不能自身合成间苯三酚的解脂耶氏酵母菌株中，构建并优化人工代谢途径，实现间苯三酚在微生物体内的积累。

关键词：解脂耶氏酵母 间苯三酚 合成生物学 微生物

The study on synthesis of resorcincinol by lipolytic yeast modified by metabolic engineering

Abstract

Lipolysis yeast is considered to be an ideal strain for the production of polyketone compounds because of its high content of acetyl-coA and malonyl-coA in cells. This study focuses on lipolysis of yersinia gigas, which has A unique citric acid shuttle pathway optimal production system of phloroglucinol through the development of synthetic biology methods. In this study, the biosynthesis of polyketocompound phloroglucinol was taken as the research object, and the newly emerging synthetic biology technology was used to construct and optimize the artificial metabolic pathway in lipolytic yeast strain that could not synthesize phloroglucinol by itself, so as to realize the accumulation of phloroglucinol in microorganisms.

Key Words: yeast lipolytic, phloroglucinol, synthetic biology, microorganism

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 间苯三酚的简介 1

1.1.1 间苯三酚的背景 1

1.1.2 间苯三酚的结构 1

1.1.3 间苯三酚的功能与应用 1

1.1.4 间苯三酚的合成方法 2

1.2 解脂耶氏酵母的简介 4

1.2.1 解脂耶氏酵母的研究背景 4

1.2.2 解脂耶氏酵母是生物合成聚酮类化合物的潜在宿主 4

1.3 间苯三酚的生物合成途径 5

1.4 本研究的创新点及意义 6

1.4.1 立意创新 6

1.4.2 思路创新 7

1.4.3 方法创新 7

第二章 实验材料与方法 8

2.1 实验材料与仪器 8

2.1.1 质粒与菌种 8

2.1.2 材料与仪器 8

2.1.3 培养基 9

2.2 菌体培养 10

2.3 片段纯化 11

2.4 质粒的提取以及胶回收方法 11

2.4.1 提取质粒的方法 11

2.4.2 胶回收方法 12

2.5 测核酸浓度 13

2.6 快提法提基因组 13

2.7 质粒DNA纯化 14

2.8 灭菌 15

2.9 Yeast转化试剂盒转化步骤 15

第三章 结果与分析 16

3.1 构建产间苯三酚的菌株 16

3.2 Puc-HUH-IntC-TEFin-phlD-XPR2t E.coli转化子验证 17

3.3 产间苯三酚重组菌株的构建 17

3.4 构建合成间苯三酚的Y.lipolytica重组菌株 19

第四章 结论与展望 21

参考文献 22

致谢 25

第一章 文献综述

1.1 间苯三酚的简介

1.1.1 间苯三酚的背景

间苯三酚又名1,3,5-三羟基苯，是合成黄酮、类黄酮药物的中间体。黄酮类化合物具有广泛的抗癌、抗心血管疾病的作用，越来越受到药物学家的重视。由间苯三酚合成的新型病毒性抗免疫缺陷药物，是第二代非核苷类逆转录酶抑制剂：间苯三酚的衍生物对于糖尿病也有治疗的功效^[1]。间苯三酚也是一种心肌性解痉药，它被广泛应用在了无痛分娩的研究中

1.1.2 间苯三酚的结构

间苯三酚（phloroglucinol）白色或淡黄色结晶或结晶性粉末。分子式为C6H6O3，分子量为126.11000，熔点218℃。通常带二分子结晶水，在110℃成无水物。溶于100份水、10份乙醇、0.5份吡啶。溶于醚。

图1-1 间苯三酚的化学结构式

1.1.3 间苯三酚的功能与应用

作为一种极其重要的精细化工品，间苯三酚的应用前景广泛，可用作染料耦合剂、防腐剂、抗氧化剂等。近年来以其生物制造为主题的研究日益深入，并已在菌种改良、底物优化、过程控制等方面取得显著成果。在此基础上，研究人员希望通过先进的生物技术手段实现高纯度的间苯三酚的生物合成，并进一步探寻其规模化生产的可能性。

1.1.4 间苯三酚的合成方法

1.间苯三酚的化学合成

目前市场上工业化化学合成为生产间苯三酚的主要方法，目其前主要作为一种药物的中间体，它要求其具有较高的纯度，但在化学合成的方法中，因氧化及酸分解过程中产生大量的副产物，使得最终产品的分离提纯比较困难，且间苯三酚的耐氧化性和热稳定性较差，用简单的物理和化学方法很难得到高纯度的产品，尤其是在医药产业中的应用对其纯度有更高的要求。

2.间苯三酚的细菌合成

在细菌界，假单胞菌是间苯三酚类化合物的来源。科学家在研究荧光假单胞菌的生物防治机制时，发现其中一种重要的有效成分是2,4-二乙酰基间苯三酚（2,4-DAPG），2,4-DAPG对于多种植物病原菌有抑制作用。Aachkar^[2]等对荧光假单胞菌2,4-DAPG合成基因簇进一步的研究表明，其产物除了它以外，也能够合成间苯三酚。在phlD基因具备完整的条件的时候，将phlA、phlB和phlC都分别进行突变，结果都是只能检测到间苯三酚，并不能检测到理想生成的物质。根据以上的实验结果证明了phlD是催化合成间苯三酚的关键基因。间苯三酚合成酶phlD是一种I I I型聚羧酸酯合成酶，可直接将三分子丙二酰辅酶a转化为工业上最重要的化学物质间苯三酚（1,3,5-三羟基苯）。虽然这种酶促反应为间苯三酚的生物合成提供了一条有吸引力的途径，但phlD的低生产率限制了其进一步的实际应用^[3]。

3.间苯三酚的生物合成

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