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摘 要

很多的体内疾病与血管的缺失和新生有关，同时血管在很多药物的药代动力学中也起着至关重要的作用。本研究采用VEGFR酪氨酸激酶抑制剂II (VRI)在体内化学诱导斑马鱼血管功能不全，进一步研究这些病理条件下血管形态发生的机制。我们通过VRI作为对照来造模了斑马鱼体内的血管抑制与新生的模型，利用脑通饮作为血管新生的恢复药物，以此来探究斑马鱼体内的血管受损后恢复与血管新生的情况。

因此我们用VRI诱导抑制血管生成，之后用脑通饮进行体内促血管实验，从而探究脑通饮对血管新生的作用，同时用若干作用于血管通路的小分子信号通路抑制剂来探究脑通饮造成血管新生所经历的作用通路，我们的实验结果表明脑通饮对斑马鱼模型的有促进血管新生的作用，通过包括阿帕替尼，索拉菲尼在内的若干条血管通路小分子抑制剂抑制的血管通路，脑通饮可能成为解决脑卒中等缺血性疾病的有效药物。

关键词： 体节间血管 肠下静脉血管 脑通饮 斑马鱼 血管新生

ABSTRACT

Many in vivo diseases are associated with loss of blood vessels and nascent, and blood vessels play a crucial role in the pharmacokinetics of many drugs. In this study, VEGFR tyrosine kinase inhibitor II (VRI) was used to induce vascular dysfunction in zebrafish in vivo, and the mechanism of vascular morphogenesis under these pathological conditions was further studied. We also explored the possibility of treating vascular insufficiency through drug intervention to promote angiogenesis and repair. We observed that VRI preconditioning inhibits angiogenesis and inhibits zebrafish blood vessels.

Therefore, we induced the inhibition of angiogenesis by VRI, and then used the brain-to-drink to conduct the in vivo pro-angiogenesis experiment, so as to explore the effect of brain-to-energy on angiogenesis, and explore the brain-passing drink with several small-molecule signaling pathway inhibitors acting on the vascular pathway. The path of action experienced by angiogenesis, our experimental results indicate that cerebral drinking has an effect on promoting angiogenesis in the zebrafish model, inhibiting small molecules through several vascular pathways including apatinib and sorafenib. The vascular pathway inhibited by the agent, brain-to-drink may be an effective drug for solving ischemic diseases such as stroke.

Keywords: ISV SIV Naotongyin Danio rerio angiogenesis

目录

摘要 2

ABSTRACT 3

第一章 文献综述 1

1.1斑马鱼模型的介绍与应用 1

1.1.1 斑马鱼简介 1

1.1.2斑马鱼在筛选抗血管抑制剂方面的的优势 2

1.2 新生血管抑制剂的研究 2

1.2.1 新生血管抑制剂的研究进展 2

1.2.2 斑马鱼作为筛选血管抑制剂的模型 3

1.3 对脑通饮的简介 3

第二章 实验材料与方法 5

2.1 引言 5

2.2 实验材料 6

2.2.1药物简介 6

2.2.3 主要试剂和耗材 6

2.2.4 主要仪器 7

2.2.5 对脑通饮体内促血管新生活性检测方法 7

2.2.5.1实验溶剂和药物的配制 7

第三章 实验结果与讨论 10

3.1 脑通饮对转基因斑马鱼体节间血管（ISV）和肠下静脉血管（SIV）的促进作用 10

3.2定量评价脑通饮对斑马鱼体节间血管（ISV）和肠下静脉血管（SIV）血管新生模型的促进作用 12

3.3 探究脑通饮信号通路实验结果 12

3.4 定量评价脑通饮的信号作用通路 14

3.4 实验总结和讨论 17

参考文献： 18

致谢 26

第一章 文献综述

1.1斑马鱼模型的介绍与应用

斑马鱼简介

斑马鱼(Danio rerio)作为一种卵生鱼类，是一种小型热带鱼，产地是东南亚一带，属于鲤科目[1]。在过去的30年里，斑马鱼作为一个有效的动物模型，已经成为研究人类各种疾病发展的一个有很大潜力的模型。斑马鱼基因组已被完全测序，其与人类基因组的相似性惊人得高，有87%的相似性[2]。据统计，70%的人类基因在斑马鱼基因组中都具有同源基因[3]。因此，许多与人类疾病相关的基因存在于斑马鱼的基因组中，通过这种很高的基因组相似度，在人类病人身上观察到的突变可以在这种动物身上进行建模。与人类相比，斑马鱼基因序列和功能的高度保守进一步证明了斑马鱼可以用来模拟人类疾病，包括心血管类疾病[4]。利用斑马鱼作为研究心血管发育及相关疾病的模型，除了具有较高的基因保守性外，还具有光学透明性好、心血管发育快、成本低等优点[5]。同时利用斑马鱼其自身的特性，近年来还在环境污染的整治方面有很大的作用。

斑马鱼是一种卵生动物，在其4-5个月到达性成熟时期。通常我们选择6个月左右的斑马鱼进行培育繁殖。对于斑马鱼这种卵生鱼类来说，其正常培育温度应控制在28.5℃左右，在这个适宜的温度下，斑马鱼一年四季无论冬夏都可以进行产卵繁殖。斑马鱼属于群居生物，平时饲养的时候，应将斑马鱼的公母分开，以便于其产卵。准备使其产卵时，前一天晚上将一对斑马鱼（一公一母）捞出放入事先准备好的斑马鱼专用产卵盒内。这种产卵盒因中间带有可拆解隔板，所以可以将公母鱼分开放置；同时在底部含有带有缝隙的挡板，斑马鱼产的鱼卵因密度较水大，可以从缝隙中落入下层，预防斑马鱼误食胚胎的情况。第二天早晨在亮灯后抽取隔板，使原本被隔板隔开的公母鱼相遇并受精，受精过程大概持续半个小时，半个小时后我们将公母鱼各自捞会原饲养鱼缸中，收取挡板下面的受精卵。进行受精后的公鱼和母鱼，均需要休息一周后才能再次进行受精产卵。受精卵的形态应为饱满、圆润的圆形球体。收到的受精卵应用0.2g/L的盐水清洗并浸泡，将其培养在28.5℃的恒温培养箱内，以便之后实验使用。

1.1.2斑马鱼在筛选抗血管抑制剂方面的的优势

斑马鱼是一种非常有价值的模型生物，同人类基因的同源率达到87%，可以替代传统的模型来检测血管生成抑制剂[6]。对透明斑马鱼胚胎和幼鱼心血管系统的探索为直接观察血液流动和血管发育提供了一个独特的机会，而无需借助复杂的仪器。基因组学研究表明，鱼类和哺乳动物的信号通路是保守的[7]。因此，对斑马鱼血管系统生物学特性的研究可以直接转化为人类疾病的相关信息。自从报道了第一个稳定的转基因斑马鱼系产生以来，已经开发了数百个转基因系。转基因斑马鱼品系Tg(flk-1:EGFP)，使观察其抗血管生成活性成为可能[8]。

斑马鱼血管结构的发育与其他脊椎动物具有高度的相似性[9]。斑马鱼胚胎血管形成的过程可以用来模拟癌症和其他良性病变中的血管生成[10]。此外，斑马鱼胚胎中体节间和肠下网血管通常被用作抗血管生成抑制剂的评价指标[11]。在胚胎发生过程中，细胞从背主动脉出来，在受精后22小时左右在体细胞边界间迁移，开始发芽。受精后2天(dpf)，大部分躯干和尾部体节间血管已形成管腔并参与血液循环[12]。在2 dpf处，肠下网血管来自居维叶导管。在2 - 3 dpf的时候，斑马鱼的肠下网血管(SIV)开始从卵黄囊下部开始形成。

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