论文总字数：20251字

摘 要

蔗糖磷酸化酶 (EC2.4.1.7，Sucrose phosphorylase) 是催化转移糖苷键的特异性酶。其能利用蔗糖作为廉价但高效的底物，生成1-磷酸-葡萄糖和D-果糖。蔗糖磷酸化酶能够催化转糖苷反应，合成各种糖苷类化合物。糖苷类化合物，在日常生活中有巨大利用价值。因此研究蔗糖磷酸化酶变成了重点。为了获得更稳定、活性高的蔗糖磷酸化酶，科学家已经进行了各种研究。

L-抗坏血酸（L-ascorbic acid， AA），又名维生素C，是参与人体内众多生理活动的水溶性维生素。AA对维持人体健康的作用被广泛认可，且能治疗坏血病，还能作为添加剂被应用于化妆品中，在化妆品、食品、保健药品等领域有广泛的利用价值。但由于其自身有还原性，很容易被氧化，不能长期保存，严重影响了其应用。研究发现，2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸（AA-2G）是AA的重要糖类衍生物。AA-2G稳定性好，安全性高，且能够通过生物法进行合成。AA-2G作为AA的替代品，具有很好的开发应用价值。

本课题以重组大肠杆菌表达的蔗糖磷酸化酶用作全细胞催化剂，合成AA-2G。研究不同的反应条件，对AA-2G产量的影响。本研究得出：采用全细胞催化时最适条件为：抗坏血酸钠600 mM，蔗糖1200 mM与菌体量15 mg/mL，在pH 7.0、55℃反应24 h。最大产量为32.89 g/L。

关键词：蔗糖磷酸化酶 AA-2G 全细胞催化

ABSTRACT

Sucrose phosphorylase is a specific enzyme that catalyzes the transfer of glycosidic bonds. This enzyme can use sucrose as an inexpensive but efficient substrate to synthesize 1-phospho-glucose and D-fructose. Sucrose phosphorylase is capable of catalyzing the synthesis of various glycosides for transglycosidic reactions. Due to the wide application of glycoside compounds in food, cosmetics, medicine and other industries, it has become a research focus to obtain a sucrose phosphorylase with high catalytic activity and good stability.

L-ascorbic acid (AA), also known as L-ascorbic acid, is a water-soluble vitamin that is widely involved in many physiological activities in the human body. Ascorbic acid is widely recognized for its role in maintaining human health and can treat scurvy. AA has extensive use in many different fields.However, due to its own instability, it is easily oxidized, which seriously affects its application. The study found that 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid (AA-2G), an important carbohydrate derivative of ascorbic acid, has good stability, high safety, and can be synthesized by biological methods as ascorbic acid. The alternative has a good development and application value.

In this study, sucrose phosphorylase expressed by recombinant E. coli was used as a whole cell catalyst to synthesize AA-2G. The study concluded that the optimal conditions for whole cell catalysis were: 600 mM sodium ascorbate, 1200 mM sucrose and 15 mg/mL of bacteria, and reacted at pH 7.0 and 55 ℃ for 24 h. The maximum yield is 32.89 g/L.

Key words：Sucrose phosphorylase；AA-2G；Whole cell catalysis

目 录

摘 要 I

ABSTRACT i

第一章 文献综述 1

1.1 前言 1

1.2 蔗糖磷酸化酶概述 1

1.2.1 蔗糖磷酸化酶的来源 1

1.2.2 蔗糖磷酸化酶分类与结构特点 1

1.2.3 蔗糖磷酸化酶的应用 2

1.3 AA-2G 3

1.3.1 AA-2G的性质和特点 3

1.3.2 AA-2G的合成 5

1.3.3 AA-2G的应用 5

1.4 全细胞催化技术 6

1.5 研究目的和内容 6

1.5.1 研究目的 6

1.5.2 研究内容 7

第二章 蔗糖磷酸化酶全细胞催化合成AA-2G 8

2.1 前言 8

2.2 实验材料 8

2.2.1 菌株 8

2.2.2 实验试剂 8

2.2.3 实验仪器 9

2.2.4 培养基 10

2.3 实验方法 11

2.3.1 菌种保藏与培养方法 11

2.3.2 重组蔗糖磷酸化酶的诱导表达 11

2.3.3 Bradford法测蛋白浓度 12

2.3.4 蔗糖磷酸化酶活力测定 12

2.3.5 全细胞催化合成AA-2G 13

2.3.6 pH、温度、反应时间、底物与蔗糖的比例及菌体量对全细胞合成AA-2G的影响 13

2.3.7 HPLC检测方法 14

2.4 实验结果与讨论 15

2.4.1 AA-2G的HPLC检测 15

2.4.2 反应pH对合成AA-2G的影响 16

2.4.3 温度对合成AA-2G的影响 17

2.4.4 底物抗坏血酸钠与蔗糖的比例对合成AA-2G的影响 18

2.4.5 反应时间对合成AA-2G的影响 19

2.4.6 菌体量对合成AA-2G的影响 19

第三章 结论与展望 21

3.1 主要结论 21

3.2 展望 21

参考文献 22

致谢 25

第一章 文献综述

1.1 前言

蔗糖磷酸化酶(EC2.4.1.7，Sucrose phosphorylase，SPase)属于糖基水解酶13家族^[1,2]。该酶以蔗糖、葡萄糖为供体^[3]，以多羟基的糖和糖醇、羧基等为受体^[4]，催化生成各种糖苷^[5]。蔗糖磷酸化酶的催化性质使它不但可以修饰改造含有醇羟基的化合物而且还能改造酚羟基及羧基的化合物，还可以催化合成某些易变性物质的衍生物，提高其稳定性。蔗糖磷酸化酶和其他的转葡糖基化催化剂相比，其优点在于，该酶可以使用蔗糖作为廉价但有效的供体底物，糖基化合成各种小分子。但是自然菌株发酵生产的蔗糖磷酸化酶，其产量和生产效率都比较低，后续反应十分困难。因此需通过基因工程的手段来重组菌株，用重组的菌株生产蔗糖磷酸化酶，运用到工业中，产生更多产品，满足人们的需要。

1.2 蔗糖磷酸化酶

1.2.1 蔗糖磷酸化酶来源

蔗糖磷酸化酶主要来源于肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenternides) ^[6]、青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）^[7]、长双歧杆菌(Bifidobacterium Jongum)^[8]、嗜糖假单胞菌( Pseudomonas saccharophila)^[9]等微生物中。在这些菌株中可以提取出蔗糖磷酸化酶，用于工业生产。但是菌株中能提取的蔗糖磷酸化酶量较少，不能大规模运用。所以需要重组构建工程菌株来生产大量的蔗糖磷酸化酶。

在运用基因工程手段构建重组菌株的过程中，发现大肠杆菌具有生长迅速，生长周期短，操作简单，安全性好，价格低的优势。因此，大肠杆菌通常用作异源表达蔗糖磷酸化酶的菌株。

1.2.2 蔗糖磷酸化酶分类与结构特点

由不同的菌株产生的蔗糖磷酸化酶的分子结构和催化性能是不同的，从而导致在所用底物的特异性上有较大的差异。

请支付后下载全文，论文总字数：20251字