论文总字数：13724字

摘 要

现如今，随着人们对疾病的认知越来越深，我们解决了许多的医学问题，但是作为全球致死率极高的病症之一，癌症，已经逐渐成为了医学界的难点问题，而在其中，原发性肺癌逐渐占到了大多数比例。国家癌症中心在2016年公布了我国癌症患者统计数据，据统计，2015年我国新发肺癌患者病例数达到了73.3万，死亡例数60.0万，居所有恶性肿瘤之首[1],而非小细胞肺癌 (non—small cell lung cancer)在其中占了80%以上。随着近些年分子靶向药物的研制，非小细胞肺癌的治疗已经从化疗为主进入到分子靶向精确治疗的阶段。克唑替尼（又称赛可瑞）是由辉瑞公司研制的抑制Met/ALK/ROS的ATP竞争性的多靶点蛋白激酶抑制剂，分别在ALK、ROS和MET激酶活性异常的肿瘤患者中证实克唑替尼对人体有显著临床疗效[2]。

斑马鱼由于在基因方面与人类具有高度的相似性从而使其成为了在实验室研究药物临床效果及安全性的有效生物模型。本实验选用了绿色荧光转基因斑马鱼（flk-1：EGFP）作为生物实验模型，对脱卵膜后的斑马鱼幼鱼进行人体癌症细胞移植，作用于克唑替尼溶液下，经过数天的培养后，通过蛋白酶将斑马鱼溶解后统计癌细胞剩余量，由此得出克唑替尼的抗肿瘤增殖活性。

关键词：肺癌 异种移植 克唑替尼 斑马鱼

ABSTRACT

Nowadays, with the deepening of people's understanding of diseases, we have solved many medical problems. However, as one of the most lethal diseases in the world, cancer has gradually become a difficult problem in the medical field, and among them, primary lung cancer gradually accounts for the majority.In 2016, the National Cancer Center published statistics on cancer patients in China. According to statistics, in 2015, the number of new cancer patients reached 733,000, and the number of deaths reached 6.6 million, ranking first among all malignant tumors, among which non-small cell lung cancer accounted for more than 80%. With the development of molecular targeted drugs in recent years, the treatment of non-small cell lung cancer (NSCLC) has entered the stage of precise molecular targeted therapy from chemotherapy. Clozotinib (also known as Sacre) is a multi-target protein kinase inhibitor developed by Pfizer to inhibit ATP competitiveness of Met/ALK/ROS. The clinical effects of clozotinib on ALK, ROS and MET kinase in patients with malignant tumors were confirmed.

Zebrafish has become an effective biological model to study the clinical efficacy and safety of drugs in laboratory because of its high genetic similarity with human beings. In this study, green fluorescent transgenic zebrafish (flk-1: EGFP) was used as a biological experimental model to transplant human cancer cells into zebrafish larvae after ovulation membrane removal. After several days of culture, zebrafish were dissolved by protease and the remaining cancer cells were counted. The anti-proliferation activity of clozotinib was obtained.

Keyword: lung cancer; xenografting; Clozotinib; Zebrafish

目录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 前言 1

第二章 文献综述 2

2.1非小细胞肺癌的特点 2

2.1.1 非小细胞肺癌的简介 2

2.1.2 非小细胞肺癌的主要治疗方法 2

2.2 斑马鱼模型的介绍与应用 3

2.2.1 斑马鱼简介 3

2.2.2 斑马鱼繁殖特点 3

2.2.3 斑马鱼养殖实验室的建立 3

2.2.4 斑马鱼模型的特点和基因优势 4

2.2.5 绿色荧光斑马鱼简介 4

2.3 克唑替尼的简介 4

第三章 实验材料与方法 6

3.1 实验材料 6

3.1.1动物材料 6

3.1.3 实验主要试剂 6

3.2 斑马鱼异种移植模型的建立 7

3.2.1 癌细胞的准备 7

3.2.2 斑马鱼异种移植模型建立准备 7

3.2.3 确定斑马鱼胚胎对克唑替尼的最大耐受剂量（MTD） 7

3.2.4 基于斑马鱼异种移植模型评价克唑替尼的抗肿瘤增殖性 8

第四章 实验结果与讨论 9

4.1 实验结果 9

4.1.1 斑马鱼胚胎对克唑替尼的最大耐受剂量（MTD）结果 9

4.1.2 基于斑马鱼异种移植模型评价克唑替尼的抗肿瘤增殖性 10

4.2实验结果讨论 12

参考文献 13

致谢 16

第一章 前言

目前，肺癌逐渐成为全球最常见的恶性肿瘤之一，全球每年大概有150万人死于肺癌，占癌症相关死亡率之首[3]。由于缺乏早期发现的有效方法，大多数患者在发现肺癌症状时已经是晚期，只能通过全身治疗来缓解痛苦。在04年出现的表皮生长因子受体（EGFR）络氨酸激酶抑制剂（TKI）是肺癌治疗进入了非小细胞肺癌（NSCLC）的靶向治疗时代[4]。2007年Soda等在肺癌中发现的棘皮动物微管相关蛋白和间变淋巴瘤激酶基因可融合为EML4-ALK基因，这个位于2号染色体的融合基因[5]可通过抑制剂来显著降低肿瘤负荷，使患者的生存时间得到大大的延长[6]。

克唑替尼作为现如今主要的AKL抑制剂，其主要靶点是AKL/MET/ROS-1。在PROFILE 1014研究中，克唑替尼的疾病控制率达到了91%。2016年9月，厦门CSCO全体大会中，多位教授做了克唑替尼对比化疗的报告。在进一步的PROFILE 1029研究中，克唑替尼显示出能显著降低癌症转移进展的趋势。

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