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摘 要

本文主要研究重组水蛭素融合蛋白的表达与纯化，研究内容主要包括优化融合蛋白表达条件和利用ITC纯化进行融合蛋白的分离纯化。

水蛭素是一种高效的抗血栓、抗肿瘤药物，但由于其体内半衰期短，且会引起一些并发症。近年来，将药物与类弹性蛋白多肽结合形成融合蛋白的给药方式，大大提高了药物在体内的半衰期，同时还能控制药物释放时间。为了提高水蛭素在医药行业的利用度，本课题将利用基因重组技术将水蛭素与类弹性蛋白多肽用凝血酶酶切位点的连接臂进行融合，得到水蛭素-ELPs融合蛋白，诱导该融合蛋白表达，优化其表达条件并提高其表达量。并利用类弹性蛋白多肽的可逆相变过程进行融合蛋白的纯化，探索该融合蛋白的纯化条件，确保在人体环境内产生更理想的作用，增强水蛭素抑制凝血酶活性的能力。

关键词：融合蛋白 水蛭素 类弹性蛋白多肽 表达与纯化

Expression and Purification of Recombinant Hirudin Fusion Protein

Abstract

In this paper, the expression and purification of recombinant hirudin fusion protein were studied. The main research contents included optimizing the expression conditions of fusion protein and purifying fusion protein by ITC purification.

Hirudin is an effective antithrombotic and antineoplastic drug, but it has a short half-life in vivo causing some complications. In recent years, the drug delivery method combining with elastin-like polypeptide to form fusion protein has greatly improved the half-life of drug in vivo and controlled the drug release time. In order to improve the utilization of hirudin in the pharmaceutical industry, we will use gene recombination technology to fuse hirudin and elastin-like peptide with the ligand of thrombin digestion site to obtain hirudin-ELPs fusion protein, induce the expression of the fusion protein, optimize its expression conditions and increase its expression. The fusion protein was purified by reversible phase transformation of elastin-like polypeptide, and the purification conditions were explored to ensure a better effect in human environment and enhance the ability of hirudin to inhibit thrombin activity.

Key wods: expression and purification；fusion protein；hirudin；elastin-like polypeptide

目录

第一章 文献综述 1

1.1弹性蛋白及其衍生物的概述与应用前景 1

1.1.1 弹性蛋白（Elastin）的简介 1

1.1.2 弹性蛋白的研究进展 1

1.1.3 类弹性蛋白多肽的简介 2

1.1.4 类弹性蛋白多肽的研究进展 3

1.2 水蛭素的概述及其应用前景 5

1.2.1 水蛭素的简介 5

1.2.2 水蛭素的研究进展 5

1.3 课题目的与意义 7

第二章 材料与方法 8

2.1实验材料 8

2.1.1 菌种与载体 8

2.1.2 实验试剂 9

2.1.3 实验仪器 10

2.2 实验方法 10

2.2.1 配制相关试剂 10

2.2.2 配制Luria Bertani（LB）培养基 11

2.2.3 SDS-PAGE蛋白胶电泳 11

2.2.4 琼脂糖凝胶电泳 13

2.2.4质粒的提取 13

2.2.5 制备感受态 14

第三章 实验内容 15

3.1 菌种活化 15

3.2 重组质粒的转化及双酶切验证 15

3.3 重组蛋白的诱导表达 15

3.3.1 最佳培养时间的确定 16

3.3.2 诱导剂最佳浓度的确定 16

3.3.3 最佳诱导时间的确定 16

3.3.4 最佳诱导温度的确定 16

3.3.5 最佳转速的确定 17

3.4 重组蛋白的ITC分离纯化 17

第四章 结果与分析讨论 18

4.1 质粒提取 18

4.2 双酶切验证 19

4.3 重组蛋白的诱导表达 20

4.3.1 最佳培养时间的确定 20

4.3.2诱导剂最佳浓度的确定 20

4.3.3 最佳诱导时间的确定 21

4.3.4 最佳诱导温度的确定 22

4.3.5 最佳转速的确定 22

4.4 重组蛋白的纯化 22

第五章 总结 24

参考文献 25

致谢 27

第一章 文献综述

1.1弹性蛋白及其衍生物的概述与应用前景

1.1.1 弹性蛋白（Elastin）的简介

弹性蛋白主要由弹性纤维组成，是一种存在于细胞外基质交联度极高的纤维状蛋白质。由于构成弹性蛋白的氨基酸以疏水性氨基酸的为主，在结构上组成的β-螺旋中，起主导作用的疏水性氨基酸侧链位于螺旋结构的内部，其余亲水性氨基酸（如甘氨酸）位于螺旋结构的外部，这种排列的方式保证这种螺旋具有亲水性、坚韧性和亲脂性，最终就决定了弹性蛋白具有弹性^[1]。大量存在于人体及哺乳动物器官和组织的弹性蛋白，使得这些需要反复受外力的部位能够发生被动收缩作用，以抵抗频繁压缩的形变，保证人体或动物体内各器官组织的功能得以正常运作^[1,2]。Dana等^[3]研究表明，弹性蛋白在组织工程中，如软骨、脊椎、腰椎、眼部、肝脏等，担任着极为重要的角色。因为弹性蛋白具有可逆形变的能力，所以其占比会根据组织和器官对弹性功能的需求程度不同而有所不同，其中在韧带中，弹性蛋白含量高达80%，而在主动脉占比30%～50%，肺中占10%～25%，皮肤中占比2%～3%^[4]。

1.1.2 弹性蛋白的研究进展

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