论文总字数：21573字

摘 要

目前，酪胺主要由化学合成法制备而来，但这种方法工艺复杂，成本较高，转化率较低并且会对环境造成严重污染，所以需要一种全新的酪胺合成路线。本文通过蛋白质的理性设计，对酪氨酸脱羧酶的酶活中心附近的β折叠区域进行丙氨酸扫描，从而筛选出影响酶活的重要氨基酸残基，进而提高酪氨酸脱羧酶的催化活力。首先，我们成功的利用蛋白模拟及分子对接软件，模拟出酪氨酸脱羧酶与酪氨酸结合的形式及位置，从而确定出突变区域；然后，利用网站设计出含突变位点的引物，完成突变体编码基因的扩增；接着，通过高效液相色谱的检测方法，测定突变体的催化活力；最后，筛选出产量最高的I439A突变菌株，酪胺产量达到0.138 g/L，是初始菌株的1.15倍。

本课题的研究主要就是通过理性分子设计完成的，通过丙氨酸扫描策略对酪氨酸脱羧酶进行分子改造，旨在增强酪氨酸脱羧酶的酶活，提高生物转化酪胺的产量，同时为酶的分子改造提供新思路。

关键词：酪氨酸脱羧酶 理性分子设计 丙氨酸扫描

Study on the Production of tyramine by Directional Modification of tyrosine decarboxylase

Abstract

Nowadays, tyramine is mainly prepared by chemical synthesis, but this method is of complex processing technology, higher cost and lower conversion rate, meanwhile, the method will cause severe contamination to the environment, so a new synthetic route of tyramine is needed. Alanine scanning is conducted in the beta-folding region near the enzyme activicity center of tyrosine decarboxylase through rational molecular design in this article, thus filtrating the important amino acid residues which affect the enzyme activicity to improve the catalytic activicity of tyrosine decarboxylase. First, we successfully used protein simulation and molecular docking software to simulate the form and location of tyrosine decarboxylase binding to tyrosine, then we could determine the mutation region;afterwards, we used website to design primers which contained mutation sites to amplify mutant coding genes. Then, we used High Performance Liquid Chromatography to detect the catalytic activity of mutants. Finally, the mutant strain I439A with the highest yield was screened, the tyramine yield reached 0.138 g/L, which was 1.15 times higher than the original strain.

The research of this subject is mainly completed by rational molecular design, and conduct the molecular of tyrosine decarboxylase through alanine scanning strategy, it’s purpose is to enhance the enzyme activity of tyrosine decarboxylase and increase the production of biology turns into tyramine, at the same time, it provides new ideas for the molecular modification of enzyme.

Key Words: tyrosine decarboxylase; rational molecular design; alanine scanning

目录

摘 要 I

Abstract I

第一章 文献综述 1

1.1 酪胺及其衍生物的简述………………………………………………………………1

1.1.1 酪胺的简介 1

1.1.2 衍生物章鱼胺和多巴胺 1

1.1.3 酪胺的合成………………………………………………………………….....2

1.1.4 酪胺的应用 3

1.2 酪氨酸脱羧酶 3

1.2.1 酪氨酸脱羧酶的简介 3

1.2.2 酪氨酸脱羧酶对于酪胺的作用 3

1.2.3 酪氨酸脱羧酶生成酪胺的研究 4

1.3 理性分子设计 5

1.3.1 定向进化 5

1.3.2 理性分子设计 5

1.4 本课题研究的意义与主要内容 5

1.4.1 本课题研究的意义 5

1.4.2 本课题研究的主要内容 6

第二章 实验材料与方法 7

2.1 实验材料 7

表2.1.1 实验主要材料 7

表2.1.2 主要实验试剂………………………………………………………………….7

表2.1.3 实验仪器…………………………………………………………………….....8

表2.1.4 引物………………………………………………………………………….....9

表2.1.5 培养基及其他主要溶液 10

2.2 实验方法 11

2.2.1 同源建模 11

2.2.2 分子对接 11

2.2.3 微生物培养 11

2.2.4 pET28a-DDC质粒提取………………………………………………………12

2.2.5 含突变位点的目的片段扩增………………………………………………...13

2.2.6 原始质粒的消化……………………………………………………………...13

2.2.7 目标片段的转化……………………………………………………………...15

2.2.8 目标片段菌落PCR…………………………………………………………...15

2.2.9 测序验证 16

2.3 突变菌株酶活的测定 16

2.3.1 突变菌株的产酶 16

2.3.2 突变体催化研究 16

第三章 结果与讨论 18

3.1 同源建模及分子对接实验 18

3.2 质粒的提取 21

3.3 突变体的构建 21

3.3.1 引物设计…………………………………………………………………….21

3.3.2 突变体核酸基因的扩增…………………………………………………….23

3.3.3 突变体的转化及菌落PCR………………………………………………….23

3.4 突变体的酶活 24

第四章 结论与展望 26

4.1 结论 26

4.2 展望 27

参考文献 28

致谢 31

文献综述

酪胺及其衍生物的简述

酪胺的简介

作为氨基酸酪氨酸的脱羧产物，酪胺是独立的神经递质，通过各种G蛋白耦合受体发挥作用。酪胺，其英文名称为Tyramine，简称为TA，分子式为C₈H₁₁NO，结构式如图1-1所示，其化学名为4-羟基苯乙胺，分子量137.18。能溶于乙醇，微溶于水、苯、二甲苯。性状为白色或类白色晶体粉末，经常用于食品添加剂和有机合成。

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