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摘 要

自噬是细胞内可观察到的一种重要生理现象，其主要参与了细胞内部降解作用与众多生化反应。自噬被证实参与了细胞生长、发育、衰老、凋亡等过程，而与自噬机制相关的疾病也逐渐被了解。正确观察细胞内自噬现象，并通过现象分析受到扰乱的自噬机制为控制自噬相关疾病提供了可能。

本研究利用分子克隆技术PCR构建了基于Gal4/UAS系统的带有荧光蛋白基因序列的自噬探针表达载体。合成的Gal4/UAS相关基因与T克隆载体连接，再由大肠杆菌整合产出质粒测序，分别构建带有转座子Tol2序列的斑马鱼胶质细胞特异表达Gal4-VP16基因与GFAP、UAS引导表达荧光自噬探针的重组表达载体，并通过斑马鱼胚胎显微注射验证表达载体的功能性表达。

关键词：gal4基因；自噬；显微注射；活体

Construction of A GFP Autophagy Probe Based on Gal4/UAS System Zebrafish

Abstract

Autophagy is a common physiology phenomenon, which major involved in degradation and biochemical reactions within cells. Autophagy has already been proved to be essential in the cell cycle. The diseases related to autophagy are being increasingly understanding now. Methods that can provide us dynamic imagination of autophagy process within cells could benefit for disease treatment in coming years.

Autophagy probe plasmid vector with GFP sequence based on the Gal4/UAS model was cloned by using PCR in our lab. E. coli produced vector T cloning integrated with Gal4/UAS genes sequences were cultured. Two plasmids, one with Tol2 sequence as well Gal4-VP16，GFAP that can be expressed in zebrafish glia cell, and the other carries UAS promotor were constructed. The expression of plasmid vector verified by zebrafish embryo microinjection.

Keywords: gal4，Autophagy，Zebrafish ，microinjection，in vivo

目录

摘 要 1

Abstract 2

第一章 文献综述 4

1.1 引言： 4

1.2 自噬相关疾病研究现状： 4

1.3 自噬与胶质细胞： 5

1.4 自噬现象细胞内的观察检测： 5

1.5 总结： 6

第二章 实验方法与实验仪器及材料 7

2.1实验仪器及材料 7

2.2 试验方法 7

第三章 研究结果 14

3.1前言 14

3.2 研究结果 15

第四章 总结与讨论 18

4.1总结 18

4.2 讨论 19

参考文献 19

致谢 21

第一章 文献综述

1.1 引言：

1955年比利时生物学家Christian de Duve发现并命名了“Lysosome”溶酶体，溶酶体中存在的三种降解机制：内吞作用，吞噬作用及细胞自噬也被发现并正式命名[1]。细胞自噬在1963得到正式命名后的很长一段时间里都仅仅被视为溶酶体腔室降解作用（degradation）步骤的一部分，直到1992年日本细胞生物学家Yoshinori Ohsumi发现了营养缺陷条件下的酵母体内自噬降解胞质现象，相关关键基因ATG也被鉴别命名[2] 。自噬作为程序性细胞死亡（PCD）的一种途径为生物体维持内环境稳态（homeostasis）起到重要的作用。细胞在衰老或受到损伤时，自噬作用可以通过溶酶体进行自我细胞器或部分细胞分解，回收并重新分配得到的蛋白用来维持细胞整体的稳态，在营养不足的情况下，细胞也会通过自噬分解部分自身获得能量来避免可能到来的细胞死亡[3]。自噬通常情况下被人为根据细胞内运输途径划分为三种：巨自噬，微自噬及分子伴侣介导自噬，这些机制在细胞的生长、发育、分化、衰老、死亡过程中都得到了观察[4]。在维持细胞内环境稳态的同时，也有研究表明自噬的过度激活会造成细胞的损伤直至诱发死亡，这证明了自噬对细胞正常生长有两面性。

1.2 自噬相关疾病研究现状：

二十一世纪以来，关于细胞自噬的研究得到了更多的关注，自噬的发生及相关调控因子得到了进一步的了解，疾病与自噬的关系在研究后得到了新的认识。 在传统的信号通路例如缺氧调节HIF-1α、能量代谢AMPK、 增殖分化ERKs等中都有发现自噬的参与，细胞自噬的影响也逐渐得到认识与研究。自噬与疾病中一个典型的例子就是细胞自噬与癌症间的关系，其中的P53抑癌蛋白通过抑制mTOR及形成LC3机制诱导调节自噬更是得到了广泛的关注，然而同时也有研究表明在癌症细胞发展后期，本应具有抑制作用的细胞自噬会被恶性肿瘤细胞利用起到保护肿瘤细胞的作用，肿瘤与自噬关系的研究仍然亟待完善[5][6]。另一类与自噬密切相关的疾病是神经系统退行性疾病（neurodegenerative disorders），其中最具有代表性的就是阿兹海默症（AD）与帕金森症（PD）[7]。研究目前认为主要有两种蛋白与导致阿兹海默综合征密切相关，TAU蛋白及β-淀粉样蛋白（Aβ）。过度磷酸化的TAU蛋白和经由β和γ分泌酶降解的淀粉样前体蛋白（APP）产生的β-淀粉样蛋白的聚合导致了阿兹海默综合征，而观察中发现的自噬体在这一病症发生中得到大量增加的现象表明了自噬被激活，进一步的研究更加表明自噬作用被β-淀粉样蛋白抑制可能是造成阿兹海默综合征的一个原因[8]。更有研究显示自噬参与了老化的过程，在部分哺乳类啮齿动物的实验中表明ATG蛋白表现出较低水平，即表明这一过程中自噬功能下降[9][10]。此外，一些胃肠道疾病与遗传性疾病例如克罗恩病（Crohn’s Disease），Vici综合症（Vici Syndrome）也被认为与自噬相关[11]。

1.3 自噬与胶质细胞：

胶质细胞包括星形胶质细胞，少突胶质细胞和小胶质细胞分布于神经系统[12]。自噬在神经损伤性疾病中可被观察到激活，小胶质细胞作为中枢神经系统主要免疫性细胞能够产生多种免疫效应分子如促炎性因子，这一过程的持续性发生将使细胞大量凋亡[12]。研究表明适当的小胶质细胞的活化会利于损伤及神经元结构的恢复，而当神经细胞受到严重损伤时，自噬便会被诱发参与到神经元结构的修复[13]。自噬在小胶质细胞过度激活时的发生能够抑制神经疾病的恶化，通过自噬来调控小胶质细胞的神经保护作用为新的神经损伤疗法提供了新的思路[14]。星形胶质细胞能够为神经元起到营养提供、保护、支撑及修复的作用, 与小胶质细胞相似的，星形胶质细胞在应对神经损伤、感染时也能使免疫介质激活，此外，星形胶质细胞也参与了神经突触的调节[15]。在关于神经性退行疾病阿兹海默综合征的研究中发现，激活的星形胶质细胞会围绕在β-淀粉样蛋白的周围将斑块包围形成屏障，与自噬作用一同一定程度的延缓AD发生[16]，而病理性改变的星形胶质细胞则会释放毒性因子从而使神经细胞损伤加剧，其具有的产生炎性作用会加剧AD的发病过程。星形胶质细胞的保护功能和在与神经性疾病中起到的相互作用仍然需要进一步的发展研究。

1.4 自噬现象细胞内的观察检测：

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