论文总字数：19560字

摘 要

多肽是一种具有生命活性的物质，在生物体中与各种细胞的功能密切相关，通过各种氨基酸的羧基和氨基脱水缩合形成的肽键连接组成。

本课题在一条疏水序列基础上，在C端（碳端）加上不同数量亲水氨基酸的合成方案来降低多肽序列的疏水度，通过对比不同方案的多肽粗品纯度、粗品收率及纯品收率等数据，对多肽合成及纯化产生的影响进行分析。原疏水序列粗品收率为46.39%，纯品收率为3.74%。当疏水度降低8%：粗品收率为69.85%，纯品收率为9.32%，相比原序列粗品收率提升23.46%，纯品收率提升5.58%。当疏水度降低14%：粗品收率为120%，纯品收率为18.73%，相比原序列粗品收率提升73.64%，纯品收率提升14.99%。由上述数据变化可确定降低多肽序列疏水度后，合成粗品收率及纯品收率都有明显的提升，从而也降低了合成及纯化的难度，对改善疏水多肽的合成及纯化方法具有参考意义。

关键词：多肽、疏水度、合成、纯化、收率

Abstract

A polypeptide is a substance having a life activity and is closely related to the functions of various cells in an organism, and is composed of peptide bonds formed by the dehydration condensation of carboxyl groups and amino groups of various amino acids.

In this study, based on a hydrophobic sequence, the synthetic scheme of different numbers of hydrophilic amino acids was added at the C-terminus (carbon terminus) to reduce the hydrophobicity of the polypeptide sequence. By comparing the crude product purity, crude yield and pure product of different protocols The rate and other data analyzed the effect of peptide synthesis and purification. The crude hydrophobic sequence yield was 46.39% and the pure yield was 3.74%. When the hydrophobicity was reduced by 8%, the crude product yield was 69.85% and the pure product yield was 9.32%. The crude product yield was increased by 23.46% compared to the original sequence, and the yield of pure product was increased by 5.58%. When the hydrophobicity was reduced by 14%: the yield of crude product was 120%, the yield of pure product was 18.73%, and the yield of crude product was increased by 73.64% compared with the original sequence, and the yield of pure product was increased by 14.99%. From the above data changes, it can be determined that reducing the degree of hydrophobicity of the polypeptide sequence leads to a significant improvement in the yield of crude product and the yield of pure product, which also reduces the difficulty of synthesis and purification, and has a reference significance for improving the synthesis and purification methods of hydrophobic polypeptides.

Keywords: Polypeptides, Hydrophobicity, Synthesis, Purification, Yield

目录

C端亲水性氨基酸序列设计对疏水多肽合成及纯化难度的影响 Ⅰ

摘要 Ⅰ

Abstract Ⅱ

第一章 文献综述 1

1.1多肽固相合成法的发明 1

1.2多肽合成的应用和发展前景 1

1.3固相合成法的原理 1

1.4固相合成中对氨基酸常用的保护方法 2

1.5氨基酸的疏水性 2

1.6分离多肽的方法 3

1.7研究思路 3

第二章 实验内容与方法步骤 4

2.1实验的材料和仪器 4

2.1.1药品和与试剂 4

2.1.2实验器材 4

2.2多肽改造及肽链的合成 5

2.2.1序列的选择 5

2.2.2聚合物树脂的选用 6

2.2.3树脂改造 6

2.2.4测量已改造树脂的取代度 7

2.2.4实验中需要检测的步骤和方法 8

2.2.5肽链合成 8

2.3切割 12

2.4离心 13

2.5确认多肽序列分子量 13

2.6 分析粗品纯度 16

2.7冻干称量多肽粗品 21

2.8纯化粗品 21

2.8.1取粗品小样试溶 21

2.8.2将粗品全部溶解 21

2.8.3 过滤粗品溶解液 22

2.8.4 纯化制备 22

2.9 纯化制备图谱 23

2.10分析制备分离出的目标峰纯度 24

2.11 收集目标物冻干称量 28

2.12 收集整理数据、计算粗品收率和纯品收率 28

第三章 数据整理、分析及结论 30

3.1对比粗品纯度和峰高 30

3.2对比粗品纯度与纯品纯度、粗品收率和纯品收率 31

第四章、结语与展望 33

4.1结语 33

4.2展望 33

参考文献 34

致谢 36

文献综述

1.1多肽固相合成法的发明

1963年，美国的生物化学家－梅里菲尔德第一次提出多肽的固相合成方法，这是个十分具有里程碑意义的有机化学合成法 ^[1]。这个方法的提出对多肽在化学有机合成领域的突破有着重大深远的影响，也带来了多肽在有机化学合成领域一次全新的改革，为人们研究多肽的世界打开一扇新的大门^[2]。在此以前，很多科学工作者对多肽合成和氨基酸保护的研究都取得了十分丰富的成绩，这些成绩为多肽固相合成法的诞生奠定了很多试验和理论的依据^[3]。

20世纪60年代末期，世界上第一台多肽合成仪器诞生了，发明人就是梅里菲尔德先生，通过这台多肽合成仪首先合成了水解蛋白质多肽－生物蛋白酶。人们因为梅里菲尔德在多肽固相合成领域的杰出贡献和突出的成绩，授予他诺贝尔化学奖 ^[1]。

1.2多肽合成的应用和发展前景

人们可以通过多肽合成来进行验证新的多肽结构构造，也可通过设计一种新的多肽结构，用来作为研究蛋白质不同构型和功能差异之间的联系，多肽合成给合成肽生物的机理、模型酶的构建和合成都提供了重要信息^[4]。生命体中具有特殊功能的生命活性物质是肽类新型的药物肽，这类肽空间排列顺序具有一定性，它的分子结构间于蛋白质和氨基酸之间。现在，多肽的化学合成方法主要有两种：一种是液相合成法，而另一种是固相合成法。固相合成法具有很多优点：1节省时间、2节约能源、3节省材料、4易于计算机控制等优点，在药物研究、蛋白质结构研究和免疫学等领域有着显著的优势^[5] 。多肽在生物制药行业和蛋白质工程等关于生命科学的领域都有着广阔的应用前景和令人瞩目的成绩。

1.3固相合成法的原理

在合成多肽链时，肽链上第一个氨基酸的羧基通过共价键连接的方式结合到所用的固相载体上（聚合物树脂) ^[6] ，然后通过脱保护将连接到固相载体的氨基酸保护基去除，裸露出来的氨基和下一个氨基酸的羧基脱水缩合形成肽键，以此为起始点，然后再不断的重复链接反应，直至完成肽链的链接^[7]。将肽合成过程浓缩成：肽洗涤-去保护-洗涤-缩合至肽合成结束，并获得目标肽链。最后，将肽链从聚合物树脂上裂解下来，然后对肽链进行进一步处理，通常肽链还要进行氧化、折叠、纯化和化学修饰等过程才能获得所需的多肽^[8]。不过随着肽链的增长，合成过程产生的副产物也会增加，合成及纯化难度也会变大。

1.4固相合成中对氨基酸常用的保护方法

在固相合成过程中常需要将氨基酸的α-氨基、α-羧基和侧链上的活性基团保护起来^[9]，常用的α-氨基保护基是：Boc（叔丁氧羰基）、Fmoc（芴氧羰基），采用Boc保护的氨基酸在合成过程中能避免受到催化氢化和碱水解的影响，且可以在切割肽链时，在加有三氟乙酸的酸性切割溶液中去除。而Fmoc保护基团是应用比较广泛的一种，通过加稀释的哌啶溶液（弱碱）就可去除。常用的α-羧基保护基之一是tBu（叔丁酯），这种保护基相对其他α-羧基保护基Me（甲酯），Et（乙酯）等更稳定，在碱性条件下不易被皂化脱掉，但可以用加有三氟乙酸的酸性切割试剂，在切割肽链时去除掉。在Fmoc合成策略中^[10]，OtBu（叔丁基酯基）保护基用于防止天冬氨酸和谷氨酸侧链活性基团发生副反应，而组氨酸侧链上巯基使用的保护基是Trt(三苯甲基)，Trt用水、三氟乙酸、盐酸都可脱除^[11]。

1.5氨基酸的疏水性

氨基酸的疏水性是因为其侧链上有疏水性很高的基团^[12]。因为合成或纯化所用的试剂均含有一定比例的水，所以在合成或纯化时含较大比例疏水氨基酸的多肽可能会因为疏水析出，增加了合成或纯化的难度^[13]。

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