论文总字数：18939字

摘 要

毕赤酵母表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一。 利用毕赤酵母胞外分泌表达α-糖苷酶，首先通过选取水稻中的α-糖苷酶基因序列，进行目的基因合成，再将其插入酵母表达载体pGAP9Kα中，得到重组表达载体。然后将构建好的重组表达载体转入大肠杆菌DH5a的感受态细胞中，进行质粒的扩增。提取重组质粒，将重组质粒pGAP9Kɑ用EcorI进行单酶切线性化后， 再用乙醇浓缩线性质粒。制备GS115感受态，将浓缩后的DNA片段电击转化进毕赤酵母GS115，通过遗传霉素G418 抗性筛选多拷贝转化子，将结果呈现阳性的转化子进行PCR菌落鉴定，选取表达良好的重组菌株进行摇瓶发酵，培养一段时间后，取上清用超滤进行浓缩，进行SDS-PAGE 电泳查看酶的表达情况，Bradford法测定蛋白浓度。最终培养获得高度转化活性的菌株，使得α-糖苷酶能够很好的在毕赤酵母中分泌表达。对粗酶进行镍柱纯化得到较纯的α-糖苷酶，对该酶的酶学性质进行研究。得到其最适温度可能为70℃，最适pH可能为5.0，最适反应时间为10min，以及对酶的温度稳定性、pH稳定性、某些金属离子对酶的抑制和激活作用进行了研究。

关键词: 毕赤酵母 α-糖苷酶 分泌表达 酶学性质

Expression and Enzymatic Properties of α-glycosidase in Pichia pastoris

ABSTRACT

The construction of a system for the expression of foreign genes by Pichia pastoris is one of the most successful and widely used methods. The extracellular secretion of α-glycosidase from Pichia pastoris is used to select the alpha-glucosidase gene in rice. Sequence, synthesis of the target gene, and then inserted into the yeast expression vector pGAP9Kα to obtain the recombinant expression vector .The recombinant expression vector was first introduced into E. coli top10, screened on LB medium containing ampicillin, and the plasmid was then introduced into E. coli DH5a to perform plasmid amplification. The plasmid was further extracted and the plasmid pGAP9Kα was linearized with a single enzyme.To prepare GS115 competent cells, the fragment of the linearized plasmid was transferred into GS115 by electroporation. The high copy number was screened using G418 and the recombinant colonies were verified by PCR.The well-expressed recombinant strain was selected for shake flask fermentation. After culturing for a period of time, the supernatant was concentrated by ultrafiltration, the molecular weight of the protein was determined by SDS-PAGE electrophoresis, and the protein concentration was determined by Bradford assay. Finally, cultured strains with high transformation activity are obtained, so that the ɑ-glycosidase can be secreted in Pichia pastoris.The crude enzyme was purified on a nickel column to obtain purer glycoside enzyme, and the enzymatic properties of the enzyme were studied. The optimum temperature may be 70°C, the optimum pH may be 5.0, the optimum reaction time is 10 min, and the temperature stability, pH stability, inhibition and activation of certain metal ions by the enzyme are studied.

Key Words :Pichia pastoris ; α- glucosidase ; Secretory expression; enzymatic properties

目录

第一章 文献综述 1

1.1 引言 1

1.2毕赤酵母的概述 1

1.2.1 毕赤酵母的性质 1

1.2.2 毕赤酵母的使用价值 1

1.3 α-糖苷酶概述 2

1.3.1 α-糖苷酶 2

1.3.2 α-糖苷酶的相关特性 2

1.4 α-糖苷酶在毕赤酵母表达系统中的表达 2

1.4.1 α-糖苷酶在毕赤酵母表达系统表达的一般步骤 2

1.4.2 α-糖苷酶在毕赤酵母系统中的表达方式 3

1.4.3 α-糖苷酶的分离纯化 3

1.4.4 影响α-糖苷酶的酶学性质的因素 3

1.5 毕赤酵母表达系统的前景 3

1.6 研究目的与意义 4

第二章 材料与方法 5

2.1 实验材料 5

2.1.1 菌株与质粒 5

2.1.2 酶与试剂 5

2.1.3 仪器与设备 6

2.2 实验方法 8

2.2.1 配制试剂 8

2.2.2目的基因的构建 8

2.2.3重组质粒转化进大肠杆菌感受态DH5α 8

2.2.4毕赤酵母电转 9

2.2.5重组菌株的筛选与鉴定 11

2.2.6目的蛋白的纯化 12

2.2.7 SDS-PAGE凝胶电泳验证目的蛋白表达及可纯化 12

2.2.8α-糖苷酶的酶学性质测定 13

第三章 实验结果与讨论 14

3.1 实验结果 14

3.1.1重组质粒进行单酶切 14

3.1.2重组菌落的PCR验证 14

3.1.3多拷贝重组菌株 15

3.1.4 蛋白浓度和酶活的测定 15

3.1.5 表达产物的 SDS-PAGE凝胶电泳 15

3.1.6 酶学性质 16

3.2 讨论 19

第四章 结论与展望 20

4.1 结论 20

4.2 展望 20

参考文献 21

第一章 文献综述

1.1 引言

具有真核表达系统的巴斯德毕赤酵母，对外源目的基因具有良好的合成，加工及表达能力，并且能保持目的基因原来优良的性能^[1]，而且可以实现外源基因分泌表达，减少产品分离的后续工序，降低生产成本。α-糖苷酶（ɑ- glucosidase）它可以从低聚糖类底物的非还原末端切开α-1，4糖苷键，释放出葡萄糖，或将游离出的葡萄糖残基转移到另一糖类底物形成α-1，6糖苷键，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖或糖酯、糖肽等。ɑ-糖苷酶在人体，植物，动物微生物的体内广泛的存在，因此获得的该酶不仅在不同领域有着很重要的使用价值，而且是一种研究结构和功能的良好材料，这都归因于其表达条件以及性质的特殊。微生物的培养时间短，数量巨大，这都是无可比拟的优点。而在这其中，以微生物产该酶的研究是比较熟练的，特别是由真菌整合表达的α-糖苷酶，因为其不但具有合适的pH值，而且稳定性相当好，更为重要的是其胞外表达和产量较好，所以它成为人们竞相研究的热点。本实验中毕赤酵母构建表达系统时利用了较为成熟的分子克隆技术，并对影响该酶的酶学性质的因素进行了研究^[2-6]。

1.2毕赤酵母的概述

1.2.1 毕赤酵母的性质

巴氏毕赤酵母是一种胞外蛋白表达体系，性能优异，在近十几年受到了无数研究者的追崇^[7]。由于毕赤酵母可以将自身所合成的外源蛋白分泌至胞外，所以也是现阶段较为使用较多的外源蛋白表达载体。与其他的微生物表达系统相比较而言，巴斯德毕赤酵母表达系统有许多的优势，如：其表达的水平比较高，兼有胞内和胞外两种表达方式；发酵的工艺已经比较成熟，可实现大规模的培养生产；发酵培养基的成分简单，成本相对较低；外源基因在毕赤酵母中比较稳定，不太会随着染色体的复制而丢失；由于其可以胞外分泌表达，可减少下游工序，降低生产成本。

1.2.2 毕赤酵母的使用价值

巴斯德毕赤酵母过去被用来生产外源蛋白，培养产蛋白基础十分牢固，数十年来人们对其的研究，使得现如今在表达外源基因方面巴氏毕赤酵母真核表达体

系^[8]的作用进一步增大，大量重组异源蛋白被成功制备。与此同时，它相比于其他酵母表达体系，有着无可比拟的长处：首先，由于它们都是单细胞生物，所以他们不仅保留了菌体培养方便的优点，而且生长速度很快，有利于大规模发酵培养；其次，表达的蛋白产量大，能够稳定遗传外源蛋白的基因，即随染色体的复制而复制，因此不易丢失^[9]；再者，带有指导信号肽分泌的序列通常会存在于一般的巴斯德毕赤酵母中，使其能在发酵液中发现所表达外源目的蛋白，使得后续的提取变得十分方便；最后，相比于一般酵母，毕赤酵母不会过度修饰目的蛋白，因此其产生的蛋白被修饰过的比例相对会较低；同时因为其所表达的目标蛋白免疫原性相比于其他的酵母所分泌的低^[9]，其产物更加有利于应用于临床实验。

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