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摘 要

糖基转移酶（Glycosyltransferases, GTs）广泛存在于植物中，它在植物的糖基化反应中扮演着重要的作用，且其糖基化产物得生物学功能对于我们人类医学来说也是具有极大的帮助，所以说研究糖基转移酶是一件非常具有意义的事情。

异槲皮素是一种槲皮素糖苷（槲皮素-3-O-葡萄糖糖苷），有非常重要的药用价值，对于治疗许多心血管疾病都有着不错的效果。然而，非常可惜的时，异槲皮素在自然界中的含量很少，制备异槲皮素的手段也比较少，目前常用的方法是芦丁水解法。虽然异槲皮素在自然界中非常的少，但是我们可以通过将槲皮素催化转换成异槲皮素，而且自然界中存在着丰富的槲皮素资源。不同的糖基转移酶可催化槲皮素的3、7、3'和4'位羟基 糖基化生成相应的单糖苷或双糖苷。本研究中选取了拟南芥来源的糖基转移酶UGT88A1以槲皮素为底物催化合成异槲皮素。通过优化表达策略，实现了该酶在原核宿主大肠杆菌中的过量表达。

关键词：糖基转移酶 重组表达 槲皮素糖苷

ABSTRACT

Glycosyltransferases (GTs) are enzymes widely found in plants. They play an important role in plant glycosylation, and their glycosylation products have biological functions for us in human medicine. It is also a great help, so it is very meaningful to study glycosyltransferases.

Isoquercetin is a quercetin glycoside (quercetin-3-O-glucoside), which has very important medicinal value and has a good effect in treating many cardiovascular diseases. However, it is a pity that the content of isoquercetin in the natural world is very low, and the method for preparing isoquercetin is relatively small. At present, the commonly used method is the hydrolysis of rutin. Although isoquercetin is extremely rare in nature, we can catalyze the conversion of quercetin to isoquercetin, and there are abundant quercetin resources in nature. Different glycosyltransferases catalyze the glycosylation at the 3, 7, 3' and 4' positions of quercetin to produce the corresponding mono- or di-glycosides. In this study, we selected the arabidopsis-derived glycosyltransferase UGT88A1 to catalyze the synthesis of isoquercetin with quercetin as substrate. By optimizing the expression strategy, overexpression of the enzyme in prokaryotic host E. coli was achieved.

KEYWORDS: Glycosyltransferase；Recombinant expression；Quercetin glycosides

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

目 录 1

第一章 文献综述 1

1.1 前言 1

1.2 什么是糖基转移酶 1

1.2.1 糖基转移酶的简述 1

1.2.2 尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶（UGTs）的来源和性质 2

1.4 异源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达研究 4

1.5 本论文主要研究内容 4

1.5.1 主要研究内容 4

第二章 糖基转移酶UGT88A1的重组表达及产物分析 5

2.1 前言 5

2.2 实验材料 5

2.2.1 菌株和质粒 5

2.2.2 实验仪器 5

2.2.3 实验试剂 6

2.2.4 工具酶，分子量标准和试剂盒 7

2.2.5 制备培养基的材料及方法 8

2.3 实验方法 8

2.3.1 序列分析 8

2.3.2 糖基转移酶UGT88A1的质粒构建 8

2.3.3 重组大肠杆菌的诱导表达及粗酶液的制备 8

2.3.4 测定糖基转移酶活性 8

2.4 结果与讨论 9

2.4.1 序列分析 9

2.4.2 重组蛋白SDS-PAGE凝胶电泳 10

2.4.3 产物HPLC鉴定 11

2.5 本章小结 13

第三章 UGT88A1的酶学性质研究 14

3.1 前言 14

3.2 实验材料 14

3.2.1 菌株和质粒 14

3.2.2 实验仪器 14

3.2.3 实验试剂 14

3.2.4 培养基及培养方法 14

3.3 实验方法 14

3.3.1 诱导表达重组质粒pRSFDuet-UGT88A1 14

3.3.2 粗酶液的制备及酶活测定方法 15

3.3.3 蛋白纯化方法 15

3.3.4 SDS-PAGE方法 15

3.3.5 酶学性质研究 15

3.3.6 异槲皮素标品溶液的配制 15

3.4 结果与讨论 16

3.4.1 绘制槲皮素-3-O-葡萄糖糖苷标准曲线 16

3.4.2 温度对糖基转移酶酶活的影响 16

3.4.3 糖基转移酶热稳定性的结论 17

3.4.4 pH对糖基转移酶酶活的影响 18

3.4.5 糖基转移酶的pH稳定性 19

3.5 本章小结 19

第四章 结论与展望 20

4.1 结论 20

4.2 展望及进一步工作的建议 20

参考文献 21

致谢 23

第一章 文献综述

1.1 前言

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