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摘 要

手性胺是重要的医药、农药中间体，具有广泛的应用前景。近年来，作为一类特殊地转氨酶，ω-转氨酶因可立体选择性催化醛、酮高效合成手性氨基化合物， 受到人们的广泛关注。本文以河流孤菌 Vibrio fluvialis JS17 中的 ω-转氨酶序列作为模板，通过基因组挖掘技术在 NCBI 中找到一株来源于根瘤菌 Rhizobium sp 的新的ω-转氨酶。随后，通过定点突变技术对该酶进行了改造，筛选出了高酶活的突变体。

利用定点突变技术进行了ω-转氨酶的改造研究，通过酶活测定和测序对突变体进行了验证和表征，并结合生物信息学技术进行了结果分析。单点突变和多点突变结果发现，E52D/G325S 突变体酶活最高，达到 17.39 U/mg，且具有更低的Km 和更高的 kcat。而 141 位和 436 位的氨基酸改变并没有明显对酶的比酶活产生显著影响。结合易错 PCR 的结果和生物信息学分析，我们发现52位和 325位的氨基酸离底物结合口袋较近，这两个位点的改变可能扩大了与底物结合的口袋。而 141 位和 426 位的氨基酸距离底物结合口袋距离较远，位点的改变不会影响底物与口袋的结合。

关键词：ω-转氨酶 酶学性质 底物谱 定点突变

Transformation of ω-transaminase from Rhizobium SP Using Site-directed Mutagenesis

Abstract

Chiral amines are important intermediates in medicines and pesticides with widely potential applications. In recent years, ω-transaminase, as a kind of special transaminase, has been recognized as a good biocatalyst for being able to catalyze the synthesis of chiral amino compounds with stereoselectivy from aldehydes and ketones.In this paper，the ω-transaminase from Vibrio fluvialis JS17, was used as a template for BLAST search in NCBI to find a new ω-transaminase from Rhizobium sp. Besides, the site-directed mutagenesis was used to evolve and screen higher activity of mutants.

The molecular modification of the ω-transaminase was also committed by using site-directed mutagenesis. The verification and characterization of the mutants was carried out by activity assay and sequencing, and the result analysis was combined with bioinformatics technology. According to site-directed mutagenesis and multipoint mutation, the specific activity of the mutant E52D/G325S was the highest, reaching 17.39 U/mg, and with lower Km while higher kcat. The changed amino acid of sites 141 and 436 did not significantly affect the enzyme activity. Combined with the result of error-prone PCR and bioinformatics analysis, we found the sites 52 and 325 amino acids are near the substrate combination pocket, and the change into two sites may expand the pockets of the substrate. And the distance of amino acids of sites 141 and 426 is far away from the pocket, the change of site will not affect the combination of substrate and pocket.

Key Words: ω-Transaminase; Enzymatic properties; Substrate specificity; Site-directed mutagenes

目 录

摘要 II

Abstract III

第一章 引言 1

1.1 转氨酶简介 1

1.1.1 转氨酶 1

1.1.2 转氨酶的分类 2

1.2 酶分子改造 2

1.3 论文研究意义和主要研究内容 3

第二章 利用定点突变技术改造 ω-转氨酶 4

2.1 前言 4

2.2 材料和仪器 4

2.2.1 实验材料 4

2.2.2 实验仪器 5

2.3 实验内容 5

2.3.1 定点突变实验方法 5

2.3.2 定点突变产物的生产与纯化 6

2.3.3 定点突变产物的酶活测定 6

2.4 结果与讨论 7

2.4.1 确定突变位点 7

2.4.2 引物设计 8

2.4.3 单点的定点突变 9

2.4.4 单点定点突变的验证 9

2.4.5 单点突变体产物的纯化 10

2.4.6 单点突变体比酶活的测定 10

2.4.7 多点突变 11

2.4.8 多点突变的验证 11

2.4.9 多点突变体产物纯化 12

2.4.10 多点突变体比酶活的测定 13

2.4.11 突变位点分析 14

2.4.12 突变体E52D/G325S酶学性质研究 16

2.5 本章小结 18

第三章 结论与展望 19

3.1 结论 19

3.2 展望 19

参考文献 21

致谢 29

第一章 引言

1.1 转氨酶简介

1.1.1 转氨酶

转氨酶作为一类 5'-磷酸吡哆醛（PLP）依赖型的重要生物催化剂，能够催化 氨基供体和氨基受体之间的氨基转移[1]。在自然界中，从 α-氨基酸到 α-酮酸的氨 基转移是转氨酶的主要作用，转氨酶的普遍存在表明它们在所有生物的氮代谢中 发挥着至关重要的作用[2-3]。一些报道的论文已经证明了来自各种各样的转氨酶 的转氨作用[2-6]，显示这些酶是用于合成手性化合物的非常有效的生物催化剂。 转氨酶通过立体选择性高效地进行氨基转移反应进而完成手性化合物的拆分和 合成，特别是 ω-转氨酶在非 α-胺类的合成领域吸引了人们的极大兴趣。

转氨酶能够利用酮类或酮酸类化合物为底物，通过立体专一性的氨基转移作 用有效合成和拆分手性化合物[7]。ω-转氨酶需要维生素B6衍生吡哆醛-5'磷酸（PLP）作为辅因子。PLP 可以将反应中间体去质子化，这种能力允许 PLP 在反 应中起辅因子的作用，包括转氨基、脱羧基、外消旋化、消除、取代和开环[8-10]。 转氨反应分成两个反应过程[11]：胺供体的氧化脱氨和胺受体的还原胺化(图 1-1）。

1.1.2 转氨酶的分类

基于转移氨基在底物结构中的位置，转氨酶（EC 2.6.1.X）可被分为 α-转氨 酶（催化氨基的转移在羧基 α 位）或 ω-转氨酶（氨基转移反应位于远离羧基的 一部分）。因此 α-转氨酶的催化反应下只能形成 α-氨基酸，自然界中大多数氨基 酸都为α构型[12]。转氨酶所催化反应中两种参与物质中至少一种不是 α-氨基酸或α-酮酸的都统一称为 ω-转氨酶，ω-转氨酶能够胺化酮酸、醛和酮[13]，如氨基位于β位的3-氨基异丁酸。事实上，ω-转氨酶原则上可以接受任何酮或胺，因此被认为更有用。它们具有较高的平衡常数，并且具有水解酶和脱氢酶的许多优点， 包括广泛的底物特异性，高对映体选择性以及不需要辅因子再生[12-17]。

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