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摘 要

本文对大肠杆菌BL21(DE3)(LU01-UGT76G1)高密度发酵产糖基转移酶的发酵工艺进行初步研究。研究表明，葡萄糖更容易被大肠杆菌代谢，并且培养基糖含量在2 g/L，不会抑制细胞的生长。此外，微量元素使用表明，基本培养基中添加一定量的金属元素没有明显的提高浓度。碳源与氮源作为细胞生长的基本营养物质，当C/N比为1：2时，细胞的密度OD600最大为115，糖基转移酶UGT76G1活性为31.27±0.73 mU/mg(Total protein)。大肠杆菌BL21(DE3)(LU01-UGT76G1)的补料方式为补料分批发酵。在5L发酵罐中，对发酵工艺进一步研究。补料策略主要有：恒速流加法、指数流加法和葡萄糖控制pH法。结果表明指数流加法，在25℃，培养24h生长条件下，细胞密度OD600稳定在100~120之间。

关键词：重组大肠杆菌 高密度培养 糖基转移酶

High density fermentation of recombinant E. coli glycosyltransferase

Abstract

In this paper, the fermentation process of high density fermentation of glycosyltransferase from E. coli BL21 (DE3)(LU01-UGT76G1) was studied. Studies have shown that glucose is more easily metabolized by E. coli and that the medium has a sugar content of 2 g/L and does not inhibit cell growth. In addition, the use of trace elements showed that the addition of a certain amount of metal elements to the basic medium did not significantly increase the concentration. The carbon source and nitrogen source were the basic nutrients for cell growth. When the C/N ratio was 1:2, the cell density OD600 was 115, and the glycosyltransferase UGT76G1 activity was 31.27±0.73 mU/mg(Total protein). The feeding mode of E. coli BL21 (DE3)(LU01-UGT76G1) was fed-batch fermentation. In the 5L fermentor, the fermentation process was further studied. Feeding strategies include: constant-rate flow addition, exponential flow addition, and glucose control pH method. The results showed that under the condition of exponential flow addition, the cell density OD600 was stable between 100 and 120 under the conditions of 25°C and 24 h growth.

Key Words：Recombinant E.coli; High-density culture; Glycosyltransferase

目 录

摘 要 I

Abstract II

目 录 III

第一章 文献综述 1

1.1前言 1

1.2糖基转移酶的简介以及分类 1

1.3重组大肠杆菌的高密度发酵 1

1.3.1大肠杆菌和高密度发酵 1

1.3.2重组大肠杆菌生产过程中的因素和控制条件 2

1.4本课题研究的意义与内容 4

第二章 重组大肠杆菌高密度发酵的各个影响因素 6

2.1前言 6

2.2实验材料 6

2.2.1 实验菌种 6

2.2.2 实验仪器 6

2.2.3 实验试剂 7

2.2.4试剂盒 8

2.2.5培养基 8

2.3实验方法 9

2.3.1Bradford法测定蛋白浓度 9

2.3.2葡萄糖的测定方法 9

2.3.3 UGT76G1酶（糖基转移酶）的测定 10

2.3.4 HPLC（高效液相色谱）方法 10

2.4实验过程 12

2.4.1甘油管制作 12

2.4.2平板活化 12

2.4.3摇管培养 12

2.4.4摇瓶培养 12

2.4.5 5L发酵罐 12

2.5实验结果和讨论 13

2.5.1培养基碳源的筛选结果 13

2.5.2微量元素的影响 15

2.5.3流加方式不同的结果 16

2.5.4 碳氮比的筛选 21

第三章 结论与展望 23

3.1 结论 23

3.2 展望 23

参考文献 24

致 谢 26

文献综述

1.1前言

很多天然物质结构上含有一个糖基，糖基化增加其本身的生物活性。天然物质的糖基化影响其自身的生理性质、选择性和药物性质。此外，一些物质糖基化后增加其品质，比如味质和溶解性等性质，还应用于化妆品和食品等行业。从甜叶菊中提取的莱鲍迪苷A，其甜度是蔗糖的200~400倍，是一个很好的食品和饮料添加剂，逐渐被应用。直接从甜叶菊中提取莱鲍迪苷A收到原料季节性影响，生物合成法可以快速合成并可以实现莱鲍迪苷A的定向修饰。酶修饰法合成莱鲍迪苷A已开始深入研究，其中关键一步是产糖基转移酶。目前，高密度发酵微生物细胞产酶是一个很好的方式。

1.2糖基转移酶的简介以及分类

糖基转移酶是一种普遍存在于植物体内的酶，它也是植物体内非常重要的一类酶。糖基转移酶主要作用是：催化激素、次级代谢物等小分子化合物的糖基化。它可将活性糖基从供体的分子上转移到受体（小分子化合物）上，从而改变这些小分子化合物的生物化学性质，这样做还可以降低或者减去其内源或者外源的毒性^[1]。植物体内的糖基转移酶的作用很多，在多糖和糖苷的生物合成中扮演重要角色，它还可以做到将活性糖基供体转移到植物受体小分子合成次级代谢产物与异质化合物等。此外，糖基转移酶可产生级联效应，这样就会直接影响植物生长。

糖基转移酶（glycosyltransferase, GT, EC 2.4.x.y）是高度分歧的多源基因家族，主要依据酶蛋白氨基酸序列相似性、有无保守序列以及催化特性进行分类^[2]。因此，糖基转移酶的分类可以通过生物信息学方法研究其与已知酶基因或酶蛋白氨基酸序列的同源性，也可以通过生物化学方法鉴定底物^[2]。国际生化与分子生物学联盟所推荐的划分依据是按照糖基转移酶的催化反应特征和底物特异性来划分糖基转移酶^[3]。

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