论文总字数：27010字

摘 要

随着生活水平的提高，人们过量食用高热量食物、糖等导致肥胖、“三高”等问题日益显著。目前，消费者越来越多地寻求健康、绿色的饮食。甜菊糖不仅具有低卡路里、高甜度等优点，同时还具备降血压、促进新陈代谢和治疗胃酸过多等多种辅助功能，是蔗糖理想的替代品。本课题以大肠杆菌为研究对象，外源表达糖基转移酶UGTSL2，以莱鲍迪苷A为底物，实现酶法催化莱鲍迪苷A合成莱鲍迪苷D。同时研究各项催化反应条件对产物产率的影响，如：蔗糖浓度、Mg² 浓度、粗酶量、pH值和反应温度等，寻求最适条件，使得产物莱鲍迪苷D产率最大化。后期还初步研究了糖基转移酶的酶学性质，期望从酶本身角度去探索，为进一步合理优化酶法合成莱鲍迪苷D提供指导意义。

本论文确定了酶法合成莱鲍迪苷D最适催化反应条件：底物莱鲍迪苷A浓度为20 g/L、蔗糖浓度为60 g/L、Mg² 浓度为3 mM、pH值为7.2以及粗酶液总蛋白浓度为6 mg/mL（总体积为20 mL），催化反应温度为30℃。并且产物莱鲍迪苷D在反应18 h时，产率达到最大，为80.6%（16.17 g/L）。

关键词： 糖基转移酶 蔗糖合成酶 莱鲍迪苷A 莱鲍迪苷D

Characterization of Glycosyltransferase UGTSL2 and Catalytic Synthesis of Rebaudioside D

ABSTRACT

With the improvement of living standards, people are over-eating high-calorie foods, sugar, etc., leading to obesity, "three highs" and other issues are increasingly significant. At present, consumers are increasingly seeking a healthy, green diet. Stevia does not only have the advantages of low calories, high sweetness, etc., but also has various auxiliary functions such as lowering blood pressure, promoting metabolism, and treating hyperacidity. It is an ideal alternative to sucrose. In this study, Escherichia coli as the research object, exogenous expression of glycosyltransferase UGTSL2, with rebaudioside A as a substrate, the enzymatic catalysis of rebaudioside A synthesis of rebaudioside D. At the same time, the effects of various catalytic reaction conditions on product yield, such as sucrose concentration, Mg² concentration, crude enzyme amount, pH value, and reaction temperature, were investigated. The optimum conditions were sought to maximize the yield of the product rebaudioside D. In the later period, the enzymatic properties of glycosyltransferases were also preliminarily studied. It is expected to explore from the perspective of the enzyme itself, which will provide guidance for the further optimization of enzymatic synthesis of rebaudioside D.

The optimal catalytic reaction conditions for enzymatic synthesis of rebaudioside D were determined in this paper: substrate rebaudioside A concentration 20 g/L, sucrose concentration 60 g/L, Mg2 concentration 3 mM, pH 7.2 The total protein concentration in the crude enzyme solution was 6 mg/mL (total volume was 20 mL), and the catalytic reaction temperature was 30°C. And the product Rebaudioside D in the reaction 18 h, the maximum yield of 80.6% (16.17 g / L).

Keywords: Glycosyltransferase；sucrose synthase； rebaudioside A；Rebaudioside D

目录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1莱鲍迪苷D（Rebaudioside D，Reb D）简介 1

1.1.1甜菊糖（Steviol glycosides）来源 1

1.1.2甜菊糖的结构 1

1.1.3 甜菊糖的前景 2

1.1.4莱鲍迪苷D的结构和性质 2

1.2 莱鲍迪苷D的研究现状 3

1.2.1 先前研究 3

1.2.2糖基转移酶（glycosyltransferases，GTs） 3

1.2.3 糖基转移酶催化生产莱鲍迪苷D 3

1.3莱鲍迪苷D的检测与鉴定 4

1.3.1甜菊糖中莱鲍迪苷A和莱鲍迪苷D的提取 4

1.3.2 莱鲍迪苷D检测 5

1.3.3. 莱鲍迪苷D鉴定 6

1.4 本论文研究目的及手段 6

第二章 酶法合成莱鲍迪苷D以及反应条件优化 7

2.1 前言 7

2.2 材料与方法 7

2.2.1 实验仪器 7

2.2.2 实验的菌株与质粒 8

2.2.3 工具酶，分子量标准和试剂盒 8

2.2.4 实验试剂 9

2.2.5菌株与培养基 10

2.3 实验方法 10

2.3.1培养基的灭菌 10

2.3.2酶的活化 10

2.3.3质粒的提取 10

2.3.4 琼脂糖凝胶电泳 11

2.3.5培养重组大肠杆菌 12

2.3.6 粗酶的制备 12

2.3.7蛋白浓度的测定 12

2.3.8酶活性的测定 13

2.4反应体系的优化 13

2.4.1反应体系 13

2.4.2 反应体系温度的改变 13

2.4.3 反应体系粗酶浓度的改变 13

2.4.5 反应体系底物蔗糖的改变 14

2.4.6 反应体系pH的改变 14

2.4.7反应体系Mg² 浓度的改变 14

2.4.8最适反应体系的确定 14

2.5 HPLC法测定莱鲍迪苷D 14

2.5.1 标品的制备 14

2.5.2 样品的制备 15

2.5.3 色谱条件 15

2.6 实验的结果与讨论 15

2.6.1 粗酶液的活性 15

2.6.2 绘制标准曲线 15

2.6.3 温度对反应体系的影响 16

2.6.4 酶浓度对反应体系的影响 17

2.6.5 底物蔗糖对反应体系的影响 17

2.6.6 pH值对反应体系的影响 18

2.6.7 Mg² 浓度对反应体系的影响 19

2.6.8最适反应体系 20

第三章 糖基转移酶UGTSL2的表征 21

3.1 粗酶的制备 21

3.2 粗酶的纯化 21

3.2.1流动相准备 21

3.2.2粗蛋白的纯化 21

3.2.3蛋白质含量测定 21

3.2.4酶活力的测定 21

3.3测定的结果 21

3.3.1蛋白纯化的结果 21

3.3.2 SDS-PAGE定性分析结果 22

3.3.3酶活力测定结果 23

3.4结论与小结 23

第四章 主要结论与展望 24

4.1 主要结论 24

4.2 展望 24

参考文献 25

致谢 29

第一章 文献综述

1.1莱鲍迪苷D（Rebaudioside D，Reb D）简介

1.1.1甜菊糖（Steviol glycosides）来源

甜叶菊原产于南美洲，是一种菊科家族的多年生灌木。现在在日本、新加坡、巴西、澳大利亚、马来西亚、中国、以色列、印度和巴拉圭等地方进行商业化种植。甜菊醇糖苷是从植物甜叶菊中提取天然的甜味化合物，作为印第安人的甜味剂已有数个世纪的历史。

1.1.2甜菊糖的结构

甜叶菊已经鉴定出超过35种不同的甜菊醇糖苷，各种糖类通过1,2-糖苷键等连接在C-13和C-19位置，如葡萄糖，鼠李糖，木糖，果糖和脱氧葡萄糖。其中三糖基化1,2-甜菊苷，四糖基化莱鲍迪苷A（Rebaudioside A，Reb A）和四糖基化莱鲍迪苷C（Rebaudioside C，Reb C），是最丰富的甜菊糖苷，这些糖苷构成叶片干重的5-10％，2-4％和叶片干重的1-2％，而莱鲍迪苷D（Rebaudioside D，Reb D）和莱鲍迪苷M（Rebaudioside M，Reb M）仅以微量存在^[1]，这些都是具有ent-kaurene骨架的二萜类糖苷，可作为甜味剂。甜菊醇糖苷的一般结构如图1所示。

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