论文总字数：19572字

摘 要

近年来我国畜牧业发展迅速，对饲料的需求量日渐增大，进口苜蓿饲料对国内苜蓿产业带来了很大的负面影响，为了增强自身竞争力，就需要在苜蓿品质等方面争取优势，研究苜蓿根际促生菌对苜蓿增产有重要意义。

本文研究用饥饿培养的方法从苜蓿根际中筛选促生菌，先富集菌株，后又用含高氨氮的培养基分离，纯化，筛选，接着进一步研究菌株的生理代谢，即植物生长素的分泌能力测定、溶磷性能测定等，以及对该菌株进行表观观察鉴定和测序鉴定。

结果表明筛选出的菌株中有三株生理生化性能比较突出，分别是N2、Z7、F16。其中F16分泌植物生长素能力最为突出，N2和Z7稍低，但是都比实验其它待测菌株要强。溶磷实验结果表明，Z7的溶磷能力最强，F16溶磷能力稍次，N2的数据明显比空白组小，排除实验误差，表明N2没有溶磷能力，或者溶磷能力很差，于是利用培养基里已有的可用磷用于细菌生长。进一步进行革兰氏染色和芽孢染色，N2是G 且有芽孢，Z7是G^-没有芽孢，F16是G^-没有芽孢。最后进行16s DNA水平鉴定，PCR后电泳图条带明亮清晰，送样检测结果表明N2是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain )，F16是类芽孢杆菌属（Paenibacillus glycanilyticus strain spp）,Z7是肠杆菌属（Enterobacter spp)。

关键词：促生菌 IAA 16s DNA

Abstract

In recent years, China's animal husbandry has developed rapidly, and the demand for feed has been increasing day by day. Imports and feeds have had a large negative impact on the domestic waste industry. In order to enhance its competitiveness, it is necessary to strive for advantages in quality and other aspects. The rhizosphere growth-promoting bacteria are of great significance to the production of earthworms.

In this paper, we used the method of hunger culture to screen the growth-promoting bacteria from the rhizosphere of the alfalfa, first enrich the strains, and then use the medium containing high ammonia nitrogen to separate, purify, and screen, and then further study the physiological and biochemical characteristics of the strains, namely auxin. The determination of the secretory capacity, the determination of the phosphorus-solubility properties, and the observation and identification of the strain and its sequencing identification.

The results showed that among the selected strains, there were three strains with prominent physiological and biochemical properties, namely N2, Z7 and F16. Among them, F16 has the most prominent ability to secrete auxin, and N2 and Z7 are slightly lower, but they are stronger than other tested strains. Phosphorus dissolution experiment results show that Z7 has the strongest P-dissolving ability, F16 has a slightly lower P-dissolving ability, and the N2 data is obviously smaller than the blank group, excluding the experimental error, indicating that N2 has no P-solubilizing ability or poor P-solubilizing. Therefore, the use of available phosphorus in the medium for bacterial growth. Gram staining and spore staining were further performed. N2 was G and spores, Z7 was G^- no spores, F16 was G^- no spores. Finally, the 16s DNA level was identified and the electrophoretogram bands were bright and clear after PCR.The results of sample delivery test indicated that N2 is Bacillus subtilis strain, F16 is Paenibacillus glycanilyticus strain spp, and Z7 is Enterobacter spp.

Keywords:Promoting bacteria；IAA；16s DNA

目录

摘要 I

Abstract II

目录 III

第一章 文献综述 1

1.1. 研究背景 1

1.1.1. 研究项目的意义 1

1.1.2. 国内外研究状况 2

1.1.3. PGPR 的概念与种类 2

1.1.4. PGPR 的作用机理 3

1.1.5. PGPR 的应用 5

第二章 实验部分 7

2.1. 培养基 7

2.2. 方法与步骤 8

2.2.1. 促生菌的富集与分离 8

2.2.2. 16 sDNA 水平鉴定 8

2.2.3. 分泌植物生长素测定 10

2.2.4. 溶磷性测试 10

2.2.5. 菌体形态学观察 11

第三章 结果与讨论 13

3.1. 数据分析 13

3.1.1. 16s DNA 水平鉴定结果 13

3.1.2. 植物生长素测定结果 14

3.1.3. 溶磷性测试结果 15

3.1.4. 菌体形态学观察结果 17

3.2. 结果讨论 19

第四章 展望 20

致谢 21

参考文献 22

文献综述

研究背景

研究项目的意义

苜蓿是豆科苜蓿属（Medicago spp）植物的通称，俗称金花菜，素有“饲料之王”之美称^[1]。是一种多年生开花植物、耐低湿、产量高而质优。紫花苜蓿（Medicago sativa）是其中最著名的牧草苜蓿，原产于伊朗，如今广布世界各地，主要用制干草、青贮饲料或用作牧草。

紫花苜蓿在我国栽培接近两千多年，从西北再到江淮流域，都有苜蓿发展的痕迹。自上世纪 80 年代以来，我国的苜蓿生产经历一系列波浪形的调整，从零基础起步，到指数发展期，但最后的稳步平台期，总的趋势在发展，但是由于基础薄弱，发展缓慢，总的苜蓿产业还是很滞后^[2]。当前，我国苜蓿生产主要集中在西北、华北和东北^[3]。国内紫花苜蓿牧草种植面积约仅为 260 万hm² 以上，由苜蓿生产的商品草产量也仅在30 万吨左右，干草平均单产在 3.75～7.50 t/hm² 左右^[4]。据统计资料显示，美国苜蓿干草平均单产一般在15t/hm^２以上^[5]。供需不平衡，其中一个原因就是苜蓿种植地域不均匀，目前苜蓿草种生产集中在陕西、甘肃、等西北一带，但是牧草需求点却遍布各地。同畜牧业发达国家相比，我国发展水平低，畜牧业生产发展还存在许多问题，都在延缓畜牧业的发展。多年以来，美国一直都是我国首要苜蓿干草的进口国，两国每年都有大量苜蓿干草交易量，进口量一直呈增加趋势，基数大，增长快^[6]。根据荷斯坦杂志报道显示，其从中国海关获得的数据统计:我国2007年的苜蓿苜蓿进口量仅0.23万吨，随着畜牧业发展，需求量增大，2017年1-6月中国的进口苜蓿总量高达83.45万吨,进口金额总计2.32亿美元，占据国内大部分苜蓿饲料交易市场份额^[7-9]。为了减轻进口苜蓿饲料对国内苜蓿市场发展的冲击及对我国苜蓿产业发展带来的压力，减轻国内苜蓿种植、生产厂商的销售压力，面对国内苜蓿生产的发展，必须采取积极手段[10-11]。农业部曾在“十三五”规划当中，具体指到需要不停创造，科技带动产业，争取 2020 年做到优质、高产、规模化、区域优势、种养结合等^[12]。

国内外研究状况

国内苜蓿发展迟滞不前，除了对苜蓿产业的战略地位认识不足、政策扶持力度不够等原因之外，最主要的原因还是苜蓿科研水平低，同时，苜蓿产量与品种潜力较低，品种抗逆能力差，更新换代缓慢^[13]。张琴,龙娟et al，就研究了pH对不同菌株增加苜蓿重量的影响，结果表明pH对菌株固氮作用，间接影响了苜蓿的生长^[14]。吴星月, 姚红丽et al还进一步研究了具体地域沧州地带不同pH对苜蓿根际菌株的影响^[15]。王卫卫，付博et al曾从紫花苜蓿(Medicago sativa)根际分离出 8 株氢氧化细菌，通过平板检测和小型盆栽实验对萌发的小麦进行促生作用表征,并利用铁载体检测实验和ACC 脱氨酶法对促生机制进行了初步研究,结果表明, 菌株 WMQ-7, FMG-3,FMG-5 对小麦的促生作用显著^[16]。郇菲菲，郭长虹et al从苜蓿根际分离一株促生菌，研究对总石油烃( TPH) 降解率的影响，结果显示该菌株增加了苜蓿对石油盐碱土壤的总石油烃的降解率^[17]。Revalska，M、lantcheva，A et al在分子层面，研究了缺磷条件下，饥饿培养导致苜蓿相关基因转录上调，增加耐磷性能^[18]。国外的Li,Jinglong、Sun,Yuqing et al研究从紫花苜蓿根际筛选无丛枝菌根的对植物抗砷污染的重要作用^[19]。同时，Xiong, PP 、He, CQ et al，也研究了紫花苜蓿对污染土壤的恢复作用，作为与蓖麻共同种植的共生植物，苜蓿对消除镉和锌污染的土壤作用尤为突出^[20]。

PGPR 的概念与种类

植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)是指自由生活在土壤或附生于植物根系的一类可促进植物生长及其对矿质营养的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌类^[21]。目前，已鉴定出 20 多个种属的 PGPR菌株，主要种类包括芽孢杆菌属 ( Bacillus spp) 、假单胞菌属( Pseudomonas spp) 、而荧光假单胞菌( Pseudomonas fluorescens) 在许多植物的根围都占了绝对优势，可达60% ～ 93%; 此外，还包括黄杆菌属( Flavobacteria spp)、固氮菌属( Azotobacter spp) 、固氮螺菌属( Azospirillum spp)、肠杆菌属( Enterobacter spp) 、欧文氏菌属( Erwinia spp) 、哈夫尼菌属( Hafnia spp) 、沙雷氏菌属( Serratia spp) 、产碱菌属( Alcaligenes spp)、节杆菌属(Arthrobacter spp) 、黄单胞菌属( Xanthomonas spp) 、克雷伯氏菌属( Klebsiella spp) 和慢生型根瘤菌属( Bradyrhizobium spp)等^[22-23]。

PGPR 的作用机理

关于PGPR的作用机理，初步可以分为两类，即间接作用和直接作用。直接作用是指 PGPR 帮助植物富集某些元素，而这些元素对植物生长极其重要，即固氮、溶磷、解钾，还能帮助植物直接合成促生长物质：如，合成植物生长素IAA。间接作用是指某些 PGPR 可以抑制或减轻土壤传染病害的发生，为了降低对植物生长发育及产量收获的不良影响，并通过诱导植物系统抗性提高植物自身对疾病的防卫机制^[24]。该分类是比较主流且全面的分类方式。PGPR 的作用机理也有另外的分类方式，一类是诱导植物产生系统抗性以抵御生物性胁迫，是指 PGPR 能帮助植物抵抗生物类侵害; 另一类是诱导植物提高耐受力以抵御非生物胁迫，例如干旱、盐分等恶劣的自然环境，PGPR 能帮助植物忍受许多种环境胁迫^[25]。

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