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摘 要

赤霉素是从水稻恶苗病菌中提取的一种强烈的生长刺激类激素，它能够快速使种子和块茎苏醒、加快植物的生长、发育与成熟。根据赤霉素的已知作用，我们可以利用它调节作物的生长，进而提高产量。主要是在植物和微生物中，科学家发现了赤霉素，所以，赤霉素的制备方法是从植物和微生物中提取，还有就是通过化学合成的方法直接合成赤霉素。将能产赤霉素的菌进行发酵在提取赤霉素的方法是生产赤霉素的主要方法，不仅可以大规模批量生产，而且生产成本相对较低。由于菌体产量，发酵条件以及后续提取等因素，是的赤霉素的生产成本依旧很高，所以改造菌体以提高赤霉素产量成为降低赤霉素生产成本的一个方法。对于这类微生物的改造，由于其基因靶向性差，所以一直阻碍其功能基因组学研究。随着CRISPR / Cas9基因组编辑技术的出现，以其高效、多功能、操作简便等特点，引发了基因研究的一场革命，为许多新的天然产物的发现和开发打开了大门。本课题是研究敲除赤霉菌基因片段，利用CRISPR / Cas9技术，完成对赤霉菌的定向改造，提高菌株的产量。

关键词：赤霉素 藤仓赤霉 CRISPR/Cas9基因编辑技术

Study on efficient CRISPR/Cas9 Genome Editing Technology for gibberellae Fujiangensis

ABSTRACT

Gibberellin is a strong growth-stimulating hormone extracted from rice bastard bacteria, which can quickly rejuvenate seeds and tubers and accelerate plant growth, development and maturation. Based on the known effects of gibberellin, we can use it to regulate the growth of crops and increase yield. The discovery of gibberellins is mainly in plants and microorganisms. Therefore, gibberellins are prepared from plants and microorganisms, and gibberellins are directly synthesized by chemical synthesis. Fermentation of gibberellin-producing bacteria in the extraction of gibberellic acid is the main method of producing gibberellin, which can not only be mass-produced in large quantities, but also has a relatively low production cost. Due to factors such as bacterial yield, fermentation conditions and subsequent extraction, the production cost of gibberellin is still very high. Therefore, it is a way to reduce the production cost of gibberellic acid by improving the production of gibberellin to increase the gibberellin production. For the transformation of these microorganisms, their functional genomics has been hindered due to their poor gene targeting. With the advent of the CRISPR / Cas9 genome editing technology, its highly efficient, versatile and easy-to-use features have triggered a revolution in gene research and opened the door to the discovery and development of many new natural products. This project mainly edited the Gibberella genome by the latest gene editing technology, CRISPR/Cas9, and directed the transformation of Gibberella fujikuroi into a high-yield strain to increase the yield.

Key words: Gibberellin, Gibberella fujikuroi, CRISPR/Cas9, genome editing technique

目 录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1研究背景 1

1.1.1赤霉素的背景 1

1.1.2 CRISPR / Cas系统背景 2

1.2 CRISPR / Cas9系统机制 3

1.2.1 cas9的表达策略 3

1.2.2 sgRNA的表达策略 3

1.2.3靶基因选择和载体构建 5

1.2.4 CRISPR / Cas9系统在丝状真菌中的应用 5

1.3实验的创新及意义 9

第二章 实验材料与方法 10

2.1 实验材料与仪器 10

2.1.1 菌种 10

2.1.2 材料与仪器 10

2.1.3 培养基 11

2.2原生质体转化法 13

2.3菌体培养 13

2.3.1抗性平板培养 13

2.3.2转化平板的培养 13

2.3.3摇瓶培养 14

2.4质粒的提取 14

2.5 DNA的凝胶回收方案 14

2.6赤霉菌基因组快提法 15

2.7体内U6 RNA三型启动子的鉴定 15

2.8 PFcas9-U6-1-fcc3和PFcas9-U6-2-fcc4质粒的构建 16

2.8.1引物的设计 16

2.8.2聚合酶链式反应 16

2.8.3 PCR产物经琼脂糖凝胶的纯化 18

2.8.4 PFcas9质粒酶切 18

2.8.5 PFcas9-U6-1-fcc3质粒和PFcas9-U6-2-fcc4的构建 19

2.8.6重组质粒PFcas9-U6-1-fcc3和PFcas9-U6-2-fcc4的转化 19

2.8.7重组质粒PFcas9-U6-1-fcc3和PFcas9-U6-2-fcc4的提取 19

2.8.8菌种保藏与片段测序 19

2.8.9赤霉菌的转化 19

2.9体外sgRNA转录 20

2.9.1仪器准备 20

2.9.2体外转录 20

2.9.3原生质体转化 21

第三章 实验结果与分析 22

3.1赤霉菌基因敲除靶点的筛选 22

3.2敲除fcc1基因验证显性基因 22

3.3设计fcc1的sgRNA 23

3.4 启动子U6-1和U6-2的确定 24

3.5 Fcc3与Fcc4的选定 25

3.6 重组质粒PFcas9-U6-1-fcc3和 PFcas9-U6-2-fcc4的构建 26

3.7体外转录 27

第四章 结论与展望 29

4.1 结论 29

4.2展望 29

参考文献 30

致 谢 34

第一章 文献综述

1.1研究背景

1.1.1赤霉素的背景

赤霉素（gibberellins，简称 GAs）主要是植物和微生物合成，是一种天然的可以作为影响植物生长的物质，随着对赤霉素的探究，我们已经发现很多不同种类的赤霉素，例如GA1、GA3、GA4、GA7等是具有功能性的赤霉素，结构如图1.1所^[1-3]。赤霉素的调节能力很强，它能够解除种子和块茎的睡眠、促进植物生长发育、加快果实成熟。因而，赤霉素应用于农作物生长过程中，可以提高产量。由于植物品种、生长阶段、使用浓度及方式的差异，赤霉素对植物的作用也有明显的差异，所以，近些年对赤霉素的生理作用研究从未间断。对赤霉素的研究中，发现赤霉素的作用越发广泛有用，所以，一些行业对赤霉素的需求越来越大。

由于赤霉素广泛存在于植物和微生物体中，所以，为了获得赤霉素，可以从植物中提取，主要是将含有赤霉素的植物破碎，用有机溶剂溶解，然后再通过一系列的物理化学手段进行分离提纯，该方法的明显缺点就是植物体赤霉素含量少，不适合批量大规模生产赤霉素，目前该方法主要是在实验室以及一些特定情况下使用。由于化学研究的进步，赤霉素还可以通过化学合成直接获得，最初科学家是用倒推法来合成赤霉素，如今，可以利用计算机来设计合成路线。然而，化学合成的方法由于其效率低、产物分离难、原料贵及路线复杂等因素，仍然不适用于工业化大规模生产。利用微生物发酵的方法生产赤霉素，具有生产的量大，生产成本降低等优点，所以，微生物发酵法成为目前生产赤霉素的主要方法。目前工业有专用的菌株生产赤霉素，它就是以丝状真菌藤仓赤霉菌（Gibberella fujikuroi），但生产成本依旧高于能够普及的水平，赤霉素不能大规模生产应用。为此，我们进行了菌种的改造，发酵条件的优化以及产物的分离提取的探索，可以看出，菌种活性以及目标基因的转录与表达的能力对菌种生产具有决定性作用。所以，我们可以通过改良菌种来提高赤霉素的产量，根据新菌种，重新设计发酵条件以及后续的提取分离。

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