论文总字数：19612字

摘 要

斑马鱼是一种常见的热带淡水鱼，它的基因和人类的基因具有高度的相似性。利用斑马鱼进行的各种生物医药实验的结果在通常情况下也可以适用于人体，因此它倍受生物学家们的重视。

本研究采用PCR等技术克隆了RFP基因序列以及斑马鱼的LCK基因的启动子序列并克隆T克隆载体。通过使用分子克隆技术，分别构建了非组织特异性表达RFP的表达载体pCS2-RFP和组织特异性表达RFP的表达载体pMD-LCK-tRFP，并通过显微注射到斑马鱼胚胎对这些表达载体进行初步的表达功能验证。

关键词：红荧光蛋白 斑马 LCK启动子 显微注射

Construction of the thymus specific RFP expression vector of zebrafish

ABSTRACT

Zebrafish is a common tropical freshwater fish. Its genes are highly similar to human genes. The results of various biological experiments carried out by zebrafish can also be applied to human body under normal circumstances. Therefore, it has attracted the attention of biologists.

In this study, RFP gene sequence and zebrafish LCK gene promoter sequence were cloned by PCR and other technologies, and T cloning vector was cloned. Through the use of molecular cloning technology, the expression vector pCS2-RFP of non tissue specific expression of RFP and the expression vector pMD-LCK-tRFP expressing the specific expression of RFP were constructed respectively, and the expression of these expression vectors was verified by microinjection of the zebrafish embryos.

Key words: RFP;Zebrafish;Promoter of LCK gene;Microinjection

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1引言 1

1.2斑马鱼作为病理模型的研究现状 1

1.3斑马鱼作为药物筛选模型的研究现状 2

1.4总结 3

第二章 实验材料与实验方法 5

2.1材料与仪器 5

2.1.1实验材料 5

2.1.2主要实验试剂 5

2.1.3主要仪器 6

2.2实验方法 7

2.2.1大肠杆菌的培养的制备 7

2.2.2大肠杆菌的感受态细胞制备 7

2.2.3大肠杆菌感受态细胞的转化方法 8

2.2.4质粒提取 8

2.2.5DNA的琼脂糖凝胶电泳 9

2.2.6在琼脂糖凝胶中提取并且回收DNA 10

2.2.7 PCR 11

2.2.8 斑马鱼的饲养以及斑马鱼卵的收集 11

2.2.9 斑马鱼胚胎显微注射 12

第三章 实验结果讨论 15

3.1 pCS2-RFP表达载体的构建 15

3.2 斑马鱼胸腺特异性表达RFP载体的构建 16

3.3 RFP表达载体显微注射斑马鱼胚胎 18

第四章 总结与展望 19

4.1总结 19

4.2 展望 19

参考文献 20

致 谢 21

第一章 文献综述

1.1引言

斑马鱼是一种相当常见的热带淡水鱼，它的基因结构组成和人类十分相近。研究者们通过对斑马鱼进行各种生理药理实验，可以顺利对人类的各种疾病的治疗产生启发并且对应使用中的药物进行效用的测定筛选，因此斑马鱼受到世界各国的生物学家们的青睐。斑马鱼作为出色的模式生物，首先繁殖能力非常强，这对于实验室养殖来说是相当的便利快捷的；其次它的发育过程多在体外完成，这就给研究者们全过程观测其发育过程提供了非常理想的条件；再者，斑马鱼透明的胚胎也非常适合观察，发育一定时间胚胎甚至可以肉眼观察；另外还有很多优点比如个体较小、性成熟的周期相对较短等均为其在各类模式生物中脱颖而出锦上添花。更加吸引科学工作者们的是，斑马鱼可以进行大规模的正向基因饱和突变与筛选，这让它的应用前景更加令人期待^[1]。这些多种多样的优点纷纷促使其成为功能基因组时代下生命科学研究中不可或缺的模式脊椎动物之一。

生命科学工作者们利用斑马鱼，在一定程度上可以轻松地研究生命科学中各种各样的基础问题，还可以通过斑马鱼的独特优势解决诸如阐释胚胎和组织器官发育的分子机理过程、构建人类各种疾病尤其是癌症肿瘤疾病的生理药理模型、建立可靠的药物筛选和特殊疾病治疗的理想研究平台以及建立具有明显遗传学优势的毒理学的理想化模型。

1.2斑马鱼作为病理模型的研究现状

目前应用广泛的斑马鱼种群作为基因组和人类有着高度的同源性的模式生物以及新型的实验动物，在各种可应用的生理药理研究中得到了广泛的应用并切实解决了许多问题。

近些年的许多医学研究中，通过斑马鱼构建出来的人类疾病模型在各类疾病研究中扮演着非常重要的角色。其中典型的疾病研究有骨骼肌肉系统、心脏相关生理器官、神经中枢系统和各种靶点的肿瘤及其并发症等方面的不少突破进展在界内影响可谓十分巨大。

在一项研究骨质疏松的医学课题上，研究人员以斑马鱼为模型同时把糖皮质激素地塞米松作为其对应的模型药,非常顺利地建立起了快速高效、形象高度匹配的骨质疏松全新模型，通过这一模型，实验人员不仅充分观察了依替膦酸二钠对斑马鱼头骨矿化的影响，同时还充分观测了这一物质对10μmol·L^-1 的地塞米松诱导的斑马鱼骨质疏松的药理反应状况，成功地发现了它对骨质疏松类疾病的具有相当可观的预防和治疗的作用。研究结果表明,地塞米松可以使斑马鱼头骨骼矿化量和骨密度发生显著的下降,这便充分论证了地塞米松可以成功诱导斑马鱼产生骨质疏松症状^[2]。同时这一模型从另一个角度非常有力地论证了依替膦酸二钠具有防止骨质疏松症的效果。

除此之外，斑马鱼作为模式生物对神经系统疾病的研究上也起到了巨大的作用，人们通过对斑马鱼中枢神经系统(central nervous system,CNS)多巴胺能(dopaminergic,DA)神经元的定位及其投射对DA神经元功能影响进行了研究，从而利用斑马鱼建立了人神经退行性疾病模型^[3]，对其作为该模型的可靠性做了许多的评估和改进，使其达到理想的模型状态，从而利用这一模型对疾病机理等一系列重要因素进行系统、详见的研究，这一系列的研究所取得的一次又一次进展让研究工作者们异常兴奋，因为它为更好地研究人类的神经退行性疾病的发病机制创造了更多的切入点，为探寻此类疾病的治疗方法增加了更多的可行性^[4]。

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