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摘 要

药物毒性和临床安全性是影响药物研发成功与否的重要因素，大量的研究表明，斑马鱼可以作为评价药物毒性的理想脊椎动物。雷帕霉素作为一类毒性小，治疗效果又好的免疫抑制剂，近年来对它的研究更加广泛。雷帕霉素及其衍生物在治疗真菌感染、肿瘤、心血管疾病等方面有着广泛的应用。在此，我们选用斑马鱼模型对雷帕霉素的毒性进行评估。设置了5个浓度梯度的药物浓度对斑马鱼早期胚胎的发育进行观察，主要观察胚胎给药后的72小时，发现浓度为0.5µmol/L及5µmol/L的实验组中出现胚胎畸形的现象，主要表现为卵黄囊水肿。此外，还发现雷帕霉素会抑制斑马鱼胚胎孵化过程，但不改变最终的孵化率，对心率、体长和存活率也有轻微的影响。

关键词：雷帕霉素 斑马鱼 胚胎发育

ABSTRACT

Drug toxicity and clinical safety are important factors affecting the success of drug development. A large number of studies have shown that zebrafish can be used as an ideal vertebrate for evaluating drug toxicity. Rapamycin is a kind of immunosuppressant with low toxicity and good therapeutic effect. It has been studied more extensively in recent years. Rapamycin and its derivatives have a wide range of applications in the treatment of fungal infections, tumors, and cardiovascular diseases. Here, we used the zebrafish model to evaluate the toxicity of rapamycin. Five concentrations of drug concentration were set up to observe the development of zebrafish early embryos. The embryos were found to be deformed in the experimental group at concentrations of 0.5 μmol/L and 5 μmol/L for 72 hours after embryo administration. Mainly manifested as yolk sac edema. In addition, it was also found that rapamycin inhibited the zebrafish embryonic incubation process but did not change the final hatching rate and had a slight effect on heart rate, body length and survival.

KEYWORDS: Rapamycin; Zebrafish; Embryonic development

目录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 雷帕霉素简介 1

1.2 雷帕霉素的作用靶点 2

1.2.1 mTOR的结构与功能 2

1.2.2 mTOR与自噬、衰老 3

1.2.3 mTOR与肿瘤 3

1.2.4 mTOR与心血管疾病 4

1.2.5 mTOR与肾病 4

1.3 斑马鱼的简介 5

1.3.1 斑马鱼的特性 5

1.3.2 斑马鱼的日常管理和繁殖 5

1.3.3 斑马鱼胚胎的早期发育 6

1.3.4斑马鱼在药物毒性及安全性评价中的应用 7

第二章 实验材料和方法 9

2.1 实验动物 9

2.2 胚胎培养液的配制 9

2.3 雷帕霉素样品 9

2.4 主要试剂和材料 9

2.5实验仪器 10

2.6 实验方法和步骤 10

2.6.1 胚胎的收集 10

2.6.2 RAPA配制及浓度选择 10

2.6.3 雷帕霉素对斑马鱼胚胎成活率、孵化率的评估 12

2.6.4 雷帕霉素对斑马鱼致畸率评估 13

2.6.5 雷帕霉素对斑马鱼心率评估 14

2.6.6 雷帕霉素对斑马鱼体长的评估 15

2.7 数据分析 15

第三章 实验结果与讨论 16

3.1 雷帕霉素对斑马鱼胚胎存活和孵化影响的结果 16

3.2 雷帕霉素对斑马鱼胚胎心率和体长影响的结果 17

3.3 雷帕霉素对斑马鱼胚胎发育畸形的影响结果 19

第四章 结论 21

4.1 结论 21

参考文献 22

第一章 文献综述

1.1 雷帕霉素简介

雷帕霉素（rapamycin，RAPA）又称西罗莫司，来源于复活节岛土壤中的一种微生物，最早是在1972年，由Surendra N.博士从此岛土壤样品中的链霉菌属hygroscopicus的次生代谢物中分离发现的^[1]。雷帕霉素分子式为C₅₁H₇₉NO₁₃，分子量为914，是一类大环内酯类化合物，与普乐可复FK-506的结构存在一定的相似性^[2]。雷帕霉素是一种具有疏水特性的化合物，这使得它的水溶解度极低，溶解速度慢,具有亲脂性，易溶于甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺、氯仿、二氯甲烷、三氯甲烷等有机溶剂中。在常温下RAPA是颜色介于白色和淡黄色之间的固体，密度为1.182g/cm³，熔点在183-185℃，一般情况下化学性质比较稳定，储存条件为-20℃下储存。

图1-1 RAPA的结构 图1-2 FK506的结构

RAPA作为新型的大环内酯类免疫抑制剂，因其具有毒性低，无肾毒，治疗效果好等优良特性^[3]，近年来，对它的研究变得更加广泛。上个世纪80年代，人们发现雷帕霉素具有抑制肿瘤细胞生长的化学活性，于是人们开始对它的化学结构进行修饰改造，以获取治疗效果更好的抗肿瘤药物。例如惠氏公司早年研发的雷帕霉素酯衍生物坦西莫司，它对治疗肾癌有一定的功效；诺华公司研制的雷帕霉素类似物飞尼妥/依维莫司陆续被批准用于肾癌、脑肿瘤、胰腺癌和乳腺癌的治疗^[4]。

1.2 雷帕霉素的作用靶点

1.2.1 mTOR的结构与功能

mTOR是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸激酶，是磷脂酰肌醇激酶相关蛋白激酶的家族成员^[5]。mTOR在进化方面高度保守，在长时间的生物进化过程中，关键部位变化很小。它可以通过整合多种细胞外的刺激信号，对生物体基因转录和蛋白质的合成产生影响，在细胞生长、增殖和凋亡中起着极其关键的作用。mTOR可以整合多种上游刺激信号，主要包括胰岛素、能量、某些氨基酸和生长因子^[6],此外，mTOR还能够感知细胞营养和能量水平。

mTOR是一类由两种不同复合物构成的大分子蛋白质，分子质量为289kDa,两种不同的复合物分别是mTORC1和mTORC2^[7]（图1-3）。其中，mTORC1有三个核心部分，包括mTOR本身、mTOR的调节相关蛋白（Raptor）和亚基mLST8，mTORC2有两个核心部分，包括mTOR本身和亚基mLST8^[8]。两种复合物在功能上也存在着一定的差异，mTORC1接受营养氨基酸、氧气含量、AMP/ATP比值等刺激后可被激活^[9]，mTORC1信号通路对代谢和分解代谢过程至关重要，主要功能是调控细胞生长、生殖和自噬等，其信号通路的活化能促进葡萄糖的利用，进而调控细胞的生长。而mTORC2信号通路在促进细胞存活和调节细胞微丝骨架方面发挥了至关重要的作用^[10]。

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