论文总字数：14457字

摘 要

本论文主要的研究内容是用Fmoc-固相多肽合成这一化学方法制备多肽药物AcSDKP。首个氨基酸上的羟基和固相载体上的连接基团，通过共价键结合在一起。从C端到N端按照肽链的顺序一直投料、缩合氨基酸的过程。每一步皆利用茚三酮这种指示剂来检验是否完全反应，直至所需肽链长度达到要求，最后使用强酸裂解得到所需粗肽。纯化过程则是选择高效液相色谱法去制备和分析多肽，使用液相色谱-质谱（LC-MS）来鉴定产品多肽的分子量，提高多肽纯度和活性。

关键词：AcSDKP 固相合成 纯化 HPLC

Synthesis and purification of an active peptide AcSDKP of hematopoietic stem cell

Abstract

The main research content of this thesis is to prepare the polypeptide drug AcSDKP by Fmoc- solid phase peptide synthesis. The hydroxyl radical of the first amino acid of the target peptide is connected in covalent form by the solid phase carrier resin, and the synthesis process of the amino acid is added and condensed from the C end to the N end in the sequence of peptide chains. In particular the previous amino acid deamination protecting group, and excessive activation under an amino acid, two amino acids handled by the combination of condensation reagent, each step is using indene three ketone this indicator to test whether the complete response to the required chain length meets the demand, finally get the required use of strong acid cracking the crude peptide. The purification process was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC), and liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) was used to identify the molecular weight of peptides and improve the purity and activity of peptides.

Key Words: AcSDKP；solid phase synthesis；purification；HPLC

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 引言 1

1.1 AcSDKP 1

1.1.1 AcSDKP的作用 1

1.1.2 AcSDKP的一级结构 1

1.2 多肽概述 2

1.3 多肽固相合成的原理 2

1.4 多肽固相合成中使用到的方法 3

1.4.1 固相合成 3

1.4.2酰胺键缩合 4

1.5 课题来源及思路 6

1.6 AcSDKP的合成与纯化的目标和意义 6

第二章 AcSDKP的合成工艺 7

2.1 实验仪器和设备、试剂 7

2.2 合成过程的检测 8

2.3 树脂的选择及改造 8

2.4 氨基酸的缩合 9

2.5 合成步骤 11

2.6 裂解及侧链保护基脱除 12

第三章 AcSDKP的纯化 14

3.1 高效液相色谱分离原理 14

3.1 仪器设备、试剂 14

3.2 色谱条件 14

3.3 AcSDKP的粗品分析 14

3.6 AcSDKP的粗品纯化 16

3.7 冻干 18

3.8 纯品分析 19

第四章 结论与讨论 20

参考文献 21

致谢 23

第一章 引言

1.1 AcSDKP

1.1.1 AcSDKP的作用

AcSDKP即为N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸（N-acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro）,它是一种生理性调节因子^[1]，相对分子质量是487.51。

AcSDKP对造血干细胞的生长有削弱功能^[2]。这个四肽链在骨髓中形成，并且保存在里面，然后缓慢连续地释放进入血液，最后分布到指定的各个器官中。AcSDKP使造血干细胞的恢复变得更快，是因为对于细胞的保护还是刺激,还需要进一步的研究来确认^[3] 。

AcSDKP是一种具有多种生物活性的四肽，近年来的研究表明这种天然小分子肽的抗纤维化作用非常的显著。它能压抑肾脏间质中的成纤维细胞的成长^[4-6]。对血管平滑肌细胞的生长也有非常明显地促进作用^[7] 。人体的睾丸中也存在AcSDKP，其与ACE共同作用下，生殖系统的功能得到调节。

1.1.2 AcSDKP的一级结构

AcSDKP的一级结构是：

图1-1 AcSDKP的一级结构

1.2 多肽概述

1963年，Merrifield提出了多肽的固相合成方法，将多肽的发展推向了更加宽广的天地^[8]。因此，Merrifield获得了1984年的诺贝尔文学奖。

多肽是由多个氨基酸按照一定的顺序排列，每个氨基酸之间通过肽键相结合的化学物质。到目前为止，已经发现的多肽有数万种。因其治疗效果良好，结构较稳定，副作用小，在很多领域都有广阔的应用前景，例如食品、医药、化妆品、农业等等。随着1990年以后，生物技术的不断成熟壮大，多肽因其安全稳定以及其生物活性涉及生物体的一切细胞，再加上固相多肽合成技术的出现和发展，越来越多的活性肽得到了开发应用，尤其在药物研发这类的医药领域大放光彩。

过去的几十年中，多肽研究得到了长足的发展，其潜在的药用研究价值让如何快速高效地合成这一内源性物质成为了研究的热门。目前常用的有液相合成法，固相合成法和微波合成法^[9]。

1.3 多肽固相合成的原理

多肽的固相合成首先是将N端被保护的氨基酸的C 端连接到固相载体上（固相载体如树脂），形成共价键。再脱去第一个氨基酸N端的保护基团，将其与过量活化的下一个氨基酸的C端通过缩合试剂相互反应形成肽键^[10]。不断重复这个步骤来延长肽链，最终合成我们所需要的多肽。其中有几点需要我们特别注意，（1）保护未参加反应的基团；（2）需活化缩合反应中形成酰胺键的羧基；（3）在这一整个反应缩合过程中，对于不参与反应的基团施行保护，且保护基不能被脱除试剂去掉，但其必须在最后的强酸裂解过程中除掉；（4）反应环境必须良好稳定，反应体系需是流动性的，这样才能保证反应的充分性。连接至所需要长度^[11]；（5）反应到最后的氨基酸的N端保护基去除以后，则要按照需求对这一端进行必要的化学修饰，根据修饰的基团判断化学修饰在裂解前还是裂解后；（6）因为强酸条件下，多肽与固相载体的连接不稳定，所以利用强酸来将我们需要的多肽与不溶性载体分离，同时强酸还可以去除多肽侧链上的保护基团。清除多肽侧链上保护基的清除剂有苯酚、EDT、TIS、水等。然后用无水乙醚离心沉淀裂解后的产物即可得到粗肽。再经过制备、纯化、分析等处理，就能得到具有生物活性的多肽^[12]。

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