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摘 要

ω-转氨酶是催化氨基酸的氨基转移到酮酸的一类酶。转氨酶具有高选择性,高转化率。磷酸吡哆醛为辅酶，在温和条件下能够催化一个氨基供体上的氨基转移到前手性的受体酮，能够得到手性氨和α-酮酸或正酮等副产物。ω-转氨酶是通过手性拆分和不对称合成的催化反应来获得光学纯的手性胺类化合物和非天然氨基酸，在医药中间体合成中是一种重要的生物催化剂。手性胺和非天然氨基酸是药物合成中的重要的中间体。非天然氨基酸对蛋白酶降解稳定性高，而且还保持其生物活性，因此，在研发稳定性高且不被人体排斥的新药，在抗体和蛋白质方面的药物当中非天然氨基酸发挥无可替之的作用。之前手性化合物是一般通过化学法来制备的，但是化学法在成本方面价格高， 光学纯度也比较低，也有污染，但生物酶法与化学法不同，能够在温和的环境条件下能够高选择性的催化生成手性化合物，无污染，对环境友好等优点。

本论文应用基因挖掘技术，在NCBI中获得一个来自根瘤菌属Rhizobium sp.AC27/96的ω-转氨酶基因，Rhizobium菌的ω-转氨酶基因在大肠杆菌BL21（DE3）中进行克隆，表达，之后通过镍柱亲和层析柱进行纯化，以丙氨酸为氨基供体，苯乙酮为氨基受体来形成主要反应体系，测定最适温度，最适pH等该酶的酶学性质。

结果表明，当丙氨酸为氨基供体，苯乙酮为氨基受体时Rhizobium具有较高的活力，其最适温度为30℃左右，最适pH在8.0左右。

关键词：ω-转氨酶 根瘤菌属 丙氨酸 苯乙酮 手性化合物

Expression and characterization of a novel ω-transaminase

Abstract

ω-transamnase is a transferase.The transaminase can catalyze the transfer of amino groups on the amino donor to the prochiral receptor ketone under mild conditions with high selectivity, high conversion rate and pyridoxal phosphate as coenzyme to obtain chi-ral ammonia and byproduct ketone or alpha-keto acid.ω-transaminase is an important bio-catalyst in the synthesis of pharmaceutical interm-ediates by obtaining chiral amines and unnatural amino-acid by kinetic resolution and asy-mmetric synthesisi. Chiral amines and unnatural amino acids are key intermediates in drug synthesis. Non-natural amino acids play an irreplaceable role in the development of non-natural amino acids in the develop-pment of novel drugs, antibodies and proteins that are highly stable and are not rejectedby human beings. Prior to the preparation of chiral compounds is chemical method,but t-he high cost of chemical method, pollution, low optical purity, but the biological enzymemethod of asymmetric catalyzed synthesis of chiral has a strong selectivity, mild reactionconditions, the ring is good Etc.

By gene data mining in NCBI,an putative ω-transaminase gene from Rhizobium sp.AC27/96 was cloned and expressed in E. coli BL21 (DE3). The recombinant was purify-ed by Ni-NTA column. Alanine(C3H7NO2) as amino donor, acetophenone(C6H5COCH3) as amino acceptor,as the main reaction system.Studied the optimum temperature, the opti-mum pH and other its c-atalytic properties and substrate profile.

The results showed that when alanine was the amino donor and acetophenone was the amino receptor,Rhizobium had high activity, the optimum temperature was about 30℃,and the optimum pH was about 8.0.

Keywords：ω-transaminase;Rhizobium sp.AC27/96;alanine;acetophenone;chiral resolution

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 转氨酶的概述 1

1.2 ω-转氨酶的概述 1

1.3 转氨反应 2

1.4 ω-转氨酶的应用 2

1.4.1 手性胺类药物 2

1.5 ω-转氨酶的研究进展 3

1.6 研究意义和主要内容 4

第二章 材料与方法 5

2.1 材料 5

2.1.1 质粒，菌株和试剂 5

2.1.2 仪器 5

2.1.3 培养基 5

2.2 基因挖掘 5

2.3 目的蛋白的表达纯化 6

2.3.1.工程菌构建 6

2.3.2诱导表达 6

2.3.3 收菌破胞 6

2.3.4 纯化透析 6

2.2.4 SDS-PAGE电泳检测 7

2.2.5蛋白含量测定 7

2.4 酶学性质测定 7

2.4.1 反应体系 7

2.4.2 最适反应温度及最适反应pH 8

2.4.3 温度耐受性和pH耐受性 9

2.4.4不同金属离子对酶活性的影响 9

第三章 结果与讨论 11

3.1 Rhizobium的表达纯化 11

3.2 Rhizobium的最适反应温度和最适反应pH 11

3.3 Rhizobium的温度耐受性和pH耐受性 12

3.4 不同金属离子对酶活力的影响 12

第四章 总结与展望 14

参考文献 15

致 谢 17

第一章 文献综述

1.1 转氨酶的概述

转氨酶是催化氨基酸的氨基转移到酮酸的羰基上的一类酶。转氨反应是可逆反应，在磷酸吡哆醛（PLP）或磷酸吡哆胺（PMP）为辅酶的作用下，两者在转氨基反应中可互相变换。转氨酶可按底物的不同分成3大类。L-α-氨基酸转氨酶，ω-氨基酸转氨酶，D-氨基酸转氨酶。

转氨酶存在的范围非常广，动植物的组织中普遍存在，连微生物中也存在。 人体内也有氨基酸进行转氨反应（约有22种），不同的组织中含有的转氨酶的含量，种类都不一样，在骨骼肌、肝、心、脑、肾、胰、脾等器官中转氨酶活力表现得最强^[1]。此外，转氨酶也在睾丸、肺、消化道、红细胞、血小板、血清等部分也有表现不同的酶活性。

1.2 ω-转氨酶的概述

ω-转氨酶是在转氨酶家族中属于第二子类。与其余转氨酶不同点在于ω-转氨酶催化的两个底物上有区别，必须要有一个为非α-酮酸或者α-氨基酸^[2]。ω-转氨酶以磷酸吡哆醛为辅酶，在温和条件下能够催化一个氨基供体上的氨基转移到受体酮上取代羰基，得到手性氨和副产物酮或者α-酮酸。目前发现在弧菌，节杆菌，色杆菌等不少种属野生菌中也存在ω-转氨酶。

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