论文总字数：21769字

摘 要

谷氨酸棒杆菌作为氨基酸行业中重要的模式生产菌株，其产品应用非常广泛。本课题利用生物合成法，以谷氨酸棒杆菌为生产菌株，在甲醇作为辅助碳源的培养基中生长代谢。天然的谷氨酸棒杆菌无法代谢甲醇，所以需要通过基因工程的方法在谷氨酸棒杆菌内构建代谢甲醇体系。甲醇脱氢酶是甲醇代谢体系中重要的酶，MDH是合成甲醇脱氢酶对应的基因片段。本实验室已有含有基因片段MDH的pET-duet质粒，选pXMJ19为转化质粒，通过pXMJ19酶切位点和MDH的序列片段设计引物对pET-duet进行PCR，获得MDH基因片段。将目的基因片段MDH与同时期获得的甲醛脱氢酶与甲酸脱氢酶片段与pXMJ19质粒进行连接，连接产物转入谷氨酸棒杆菌，构建工作完成后，检测构建后谷氨酸棒杆菌代谢甲醇的情况，实验结果是甲醇代谢体系的成功构建后，谷氨酸棒杆菌可以在以甲醇为辅助碳源的甲醇葡萄糖共利用培养基上生长代谢。对构建后谷氨酸棒杆菌产L-鸟氨酸途径进行优化，最后优化发酵生产L-鸟氨酸。

关键词：Mdh pXMJ19 甲醇代谢体系

Metabolic modification of L- ornithine synthesized by glucose, glucose and methanol using glutamic acid bacteria

Abstract

Corynebacterium glutamic acid, as an important model producing strain in amino acid industry, is widely used. In this study, the Corynebacterium strain was produced by biosynthesis, and the growth and metabolism of methanol in the medium of methanol as an auxiliary carbon source was studied. The natural glutamic acid rod bacillus can not metabolize methanol, so it is necessary to construct metabolic methanol system through gene engineering method. Methanol dehydrogenase is an important enzyme in the metabolic system of methanol, and MDH is the gene fragment corresponding to the synthesis of methanol dehydrogenase. PET-duet plasmid containing gene fragment MDH has been selected in this laboratory, and pXMJ19 is selected as the transformed plasmid. Primers are designed through pXMJ19 restriction site and MDH sequence, and PCR is obtained from pET-duet, and MDH gene fragments are obtained. To obtain MDH gene fragment with the same period of the HPS and PHI fragment and pXMJ19 plasmid were connected into Corynebacterium glutamicum connected product, the construction work is completed, the construction of detection of Corynebacterium glutamicum metabolism of methanol, the results of the experiment are methanol metabolism system successfully constructed, Corynebacterium glutamicum in methanol methanol glucose as the auxiliary carbon source based on the growth and metabolism of medium. To optimize the production of L- ornithine pathway after construction of glutamic acid Corynebacterium, and finally optimize the production of L- ornithine.

Key Words: MDH;pXMJ19; Methanol metabolism system

目 录

摘要………………………………………………………………………………...I

Abstract…………………………………………………………………………....II

第一章 文献综述 1

1.1 单碳化合物与甲醇 1

1.1.1 单碳化合物与甲醇简介 1

1.1.2 甲基营养菌简介 1

1.2 谷氨酸棒杆菌 2

1.2.1 谷氨酸棒杆菌形态特征 2

1.2.2 谷氨酸棒杆菌的理化性质 2

1.2.3 谷氨酸棒杆菌的应用 2

1.3 L-鸟氨酸 3

1.3.1 L-鸟氨酸的理化性质 3

1.3.2 L-鸟氨酸的应用前景 3

1.3.3 L-鸟氨酸的制备方法 3

1.4 研究内容 5

第二章 实验材料及方法 6

2.1 实验材料 6

2.1.1 实验器材 6

2.1.2 种子液和发酵液配方 7

2.1.3 实验菌株 7

2.2 培养基及溶液配制 8

2.2.1 LB平板的配制 8

2.2.2 种子液及发酵液的配制 8

2.3 实验步骤 9

2.3.1 菌株的活化 9

2.3.2 接入种子液 9

2.3.3 目的基因的获得 9

2.3.4 MDH的扩增 10

2.3.5 MDH基因与pXMJ19质粒的连接与转化提取 11

2.3.6 谷氨酸棒杆菌感受态的制备和转化方法 12

2.3.7 谷氨酸棒杆菌中基因组的小提 13

2.3.8 比较原始菌株与构建甲醇代谢菌株的生长情况 13

2.3.9 发酵生成L-鸟氨酸 14

第三章 实验结论与分析 16

3.1实验结果分析 16

3.1.1 pET-duet质粒的提取 16

3.1.2 PCR结果图 16

3.1.3 pXMJ19质粒中MDH质粒的提取 17

3.1.4 谷氨酸棒杆菌中MDH质粒的提取 18

3.1.5 原始菌株与构建甲醇代谢菌株生长曲线 19

3.1.6 L-鸟氨酸的产量比较 20

3.2 实验讨论 21

3.2.1 甲醇利用途径基因表达对谷氨酸棒杆菌生长的影响 21

3.2.2 新的研究方向 22

第四章 应用展望 24

致谢 25

参考文献 26

第一章 文献综述

1.1 单碳化合物与甲醇

1.1.1 单碳化合物与甲醇简介

单碳化合物是指只含有碳碳单键的化合物（如甲烷、甲醛），此类化合物的结构一般相较于其他化合物而言相对简单且来源广泛。甚至很多物质是在工业农业生成中产生的副产物，有些还对人体有害且带有毒性，给水体环境等造成很大破坏和严重影响。由于上述原因，这些物质的处理就成为国内外研究者们关心的问题。其中关于甲醇的处理研究，也是全球科学家关注的焦点。

有机化合物甲醇(CH₃OH)是一种普通的一元醇类。本身没有颜色，并且特别容易被点燃，且较容易挥发，是有机合成原理药品等重要的工业原料。甲醇本身具有非常强的生物可降解性，而这个特点对于生物法处理甲醇非常有利。生物法降解甲醇不仅能有效解决污染问题，还能在处理污染的同时生产出蛋白质、氨基酸等具有应用价值的物质，不仅实现了污染的处理，也造福于生活。所以从上个世纪开始，相关的研究就已经开展。

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