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摘 要

本文目的是对嗜热链球菌来源的胱硫醚裂解酶进行研究。本论文以嗜热链球菌Streptococcus thermophilus 的基因组为模板，成功克隆了胱硫醚裂解酶CS的基因，构建了带有胱硫醚裂解酶基因的基因工程菌BL21(pET-22b-CS)，经过诱导表达，SDS-PAGE显示在45.7 KD处有明显的表达条带。对以胱硫醚为底物的反应产物进行HPLC鉴定后确定该酶为胱硫醚β裂解酶，其比活力为19.39 U/mg蛋白。对该酶的酶学性质进行表征后发现，该酶的最适反应温度为45℃，低于40℃的条件下保存剩余活性最高；最适反应pH为7.0，且该pH下保存效果最好。胱硫醚β裂解酶是微生物硫代谢过程中比较重要的酶，通过本研究对于了解微生物该过程有着重要意义。

关键词：胱硫醚裂解酶 嗜热链球菌 基因工程 硫代谢

ABSTRACT

The purpose of this paper is to study the cystathionine lyase from Streptococcus thermophilus. In this paper, we successfully cloned cystathionine lyase gene and constructed genetically engineered bacteria BL21 (pET-22b-CS). SDS-PAGE showed the enzyme was successfully expressed. We identified the cystathionine β-lyase activity of this enzyme by HPLC, and the specific activity was 19.39U/mg protein. We studied the enzymatic properties of this enzyme. The results showed that the optimum temperature of this enzyme was 45℃ and the store temperature should under no more higher than 40℃. We also found the optimum operation pH and store pH is 7.0. Cystathionine β-lyase is an important enzyme of microbial sulfur metabolism, this study has great significance to understand the mechanism of this pathway.

KEYWORDS: Cystathionine lyase; Streptococcus thermophiles; genetic engineering; Sulfur metabolism

目录

摘要 Ⅰ

ABSTRACT Ⅱ

目录 Ⅲ

第一章 文献综述 1

1.1 C-S裂解酶简介 1

1.2 C-S裂解酶的分类 1

1.2.1 胱硫醚β-裂解酶 1

1.2.2 胱硫醚γ裂解酶 2

1.3 胱硫醚裂解酶的影响 3

1.4 本课题的研究目的及意义 3

第二章 实验材料与方法 5

2.1 实验材料 5

2.1.1 常用试剂 5

2.1.2 主要仪器 6

2.1.3 工具酶及试剂盒 7

2.1.4 菌株及质粒 7

2.2 实验方法 7

2.2.1 培养基及培养方法 7

2.2.2 嗜热链球菌基因组的提取 8

2.2.3 目的基因的获取 8

2.2.4 重组质粒pET-22b-CS的构建及鉴定 9

2.2.5 CS的表达和纯化 10

2.3 分析方法 11

2.3.1 胱硫醚αβ和αγ活性的鉴定 11

2.3.2 胱硫醚裂解酶最适pH及pH稳定性的测定 11

2.3.3 胱硫醚裂解酶最适温度及温度稳定性的测定 11

2.3.4 胱硫醚裂解酶动力学常数的测定 12

第三章 结果与讨论 13

3.1 胱硫醚裂解酶基因在大肠杆菌中的克隆 13

3.2 胱硫醚裂解酶的性质研究 16

3.2.1 胱硫醚αβ和αγ活性的鉴定 16

3.2.2 胱硫醚裂解酶最适pH及pH稳定性 17

3.2.3 胱硫醚裂解酶最适温度及温度稳定性 18

3.2.4 胱硫醚裂解酶动力学常数 19

第四章 结论与展望 20

4.1 结论 20

4.2 展望 20

参考文献 21

致谢 22

第一章 文献综述

1.1 C-S裂解酶简介

酸奶因其营养丰富，风味别致，营养价值高，一直是颇受欢迎的健康食品。酸奶含有酶类、矿物质、乳酸、维生素、氨基酸等能够促进人类生长发育和维持健康的多种营养成分。酸奶的风味是消费者评价的重要指标^[3]。国内外专家对不同发酵乳的风味成分测定分析后，发现其组成包括酸类、酯类、醇类、羰基化合物、芳香族化合物、杂环化合物、蛋白水解物和含硫化合物等。

研究表明，微生物的硫代谢过程在乳制品中含硫化合物的产生过程中起关键作用。与风味有关的含硫化合物主要由微生物的转氨反应过程和裂解反应过程产生，C-S裂解酶在裂解反应中起着重要作用。嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌是乳制品加工过程中常用的发酵菌株。研究表明，嗜热链球菌对酸奶的味道影响较大，是主要的风味物质产生菌。因此有必要对嗜热链球菌中的C-S裂解酶进行研究，从而更好地了解微生物的硫代谢过程^[2]。

1.2 C-S裂解酶的分类

1.2.1 胱硫醚β裂解酶

胱硫醚β裂解酶参与甲硫氨酸的生物合成代谢过程^[1-11]，可以切除L-胱硫醚β位的C-S键，如图1-1所示将L-胱硫醚裂解为同型半胱氨酸，丙氨酸和氨^[5]。胱硫醚β裂解酶已经被证实存在于几个哺乳动物的组织和细菌中^[12]。1970年Guarneros和Ortega在大肠杆菌中发现胱硫醚β裂解酶。1973年Collins、Monty和Kredich 等人在鼠伤寒沙门氏菌中发现了胱硫醚β裂解酶。1995年Alting等人在乳酸乳球菌中检测到了胱硫醚β裂解酶活性，1998年Smacchi和Gobbetti1在发酵乳杆菌中检测到胱硫醚β裂解酶活性。并且1997年Breuinenberg等人将胱硫醚β裂解酶纯化^[6]。

图1-1 胱硫醚β裂解酶反应过程

1.2.2 胱硫醚γ裂解酶

胱硫醚γ裂解酶作为转硫途径的重要的裂解酶，以磷酸吡哆醛为辅因子^[7]，能够将L-胱硫醚催化裂解为L-半胱氨酸、L-酮丁酸、和氨^[8]。如图1-2所示，Carroll等人第一次在大鼠肝脏中提取发现胱硫醚γ裂解酶。Matsuo和Greenberg通过大鼠肝脏中的酶进行结晶核纯化得到。胱硫醚γ裂解酶也被发现存在于粗糙脉孢菌、构巢曲菌、酿酒酵母中^[4]。研究表明，胱硫醚γ裂解酶具有16600的分子量，由4个分子量相同的亚基组成，在278nm和421nm处有最大吸收值^[6]。Weiwer等人在1999年研究得出，胱硫醚γ裂解酶能够通过α-γ消除反应转化为其他含硫化合物^[9]。

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