论文总字数：25948字

摘 要

NADPH及NADH是细胞重要的还原力，与很多连贯的生物分子的生成过程关系密切，在拥有这些代谢产物产出能力的微生物菌株里，通过上升NADPH及NADH的供给，能增加产物地生成量，让菌株性质功能等向完美方向发展。本研究构建在谷棒杆菌中诱导型表达NADP依赖型、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因gapB和gapN的重组菌株，在已有谷氨酸棒杆菌好氧产瓜氨酸的发酵工艺基础上进行摇瓶发酵实验。在好氧发酵36 h后，gapB和gapN的诱导表达菌的瓜氨酸产量（19.1±1.2 mM）和（17.6±1.1 mM）比出发菌株39#（14.6±0.9 mM）提高了30.8%和20.5%，说明通过表达gapB以及gapN基因可达到上升胞内NADPH的供给，这是有利于瓜氨酸积累的。本研究为通过辅酶调控手段来提高胞内NADPH的供给，从而运用于氨基酸地生成提供了一定得参考依据。

关键词：瓜氨酸，GAPN，谷氨酸棒杆菌

ABSTRACT

NADH and NADPH is cell reduction force, participate in the process for the synthesis of a series of biological molecules, with strains of these metabolites synthesis and by increasing the supply of NADH and NADPH, can promote the product synthesis, strain optimization performance. This study constructed in Corynebacterium glutamicum inducible expression of NADP - dependent type glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene gapb and gapn recombinant strains, in existing glutamate Corynebacterium good oxygen producing citrulline fermentation process based on shaking flask fermentation experiments. In aerobic fermentation 36 h and gapb and gapn induced expression bacteria citrulline production (19.1 1.2 mm) and (17.6 1.1 mm) than that of the starting strain 39# (14.6 0.9 mm) improves the 30.8% and 20.5%, indicating that the gapb and gapn gene expression to improve the intracellular NADPH supply is conducive to the accumulation of melon ammonia acid. This study provides a reference for the production of amino acids by improving the supply of intracellular NADPH by means of coenzyme regulation.

Key words: L-citrulline, GAPN, Corynebacterium glutamicum

目录

摘要 II

ABSTRACT III

目录 IV

第一章 绪论 1

1.1 瓜氨酸简介 1

1.2 NADPH的供应渠道 3

1.2.1 通过磷酸戊糖途径补给NADPH 3

1.2.2 采用NAD激酶产生NADPH 4

1.2.3 NADPH 的其他供应方式 5

1.3 谷氨酸棒杆菌糖酵解代谢工程简介 6

1.4 本文的研究目的和研究内容 8

1.4.1 本文的研究目的 8

1.4.2 本文的研究内容 8

第二章 材料与方法 9

2.1 实验材料 9

2.2.1 实验仪器 9

2.2.2 实验试剂 10

2.2.3 菌株与质粒 11

2.2.4 培养基及培养条件 11

2.2 实验方法 12

2.2.1 基因工程操作方法 12

2.2.2 主要的分析方法 13

第三章 结果与讨论 15

3.1 过表达gapB和gapN的工程菌生长与葡萄糖消耗情况 15

3.2 过表达gapB和gapN的工程菌的氨基酸积累情况 15

第四章 结论与展望 17

参考文献 18

致谢 23

第一章 绪论

1.1 瓜氨酸简介

L-瓜氨酸（L-citrulline），别名叫做氨基甲酰鸟氨酸(carbamylomithine omithin)，它是一种α-氨基酸，也是一种非蛋白质氨基酸。它得名于日本科学家右贺太郎等从西瓜汁中第一次分离获得，经后判定它是一种氨基酸。目前已经知晓，L-瓜氨酸拥有许多重要的生理性功能：例如促进血管舒张，使血压稳定，能够吸收有害的自由基，有抗氧化能力，可以确诊判断类风湿关节炎等疾病，尤其是，血清瓜氨酸还可以作为检验肠道移动植入时的指示剂，用来表示异体排斥效应程度，用于肾脏移植过程中血脲酸的检测，用于肝脏移植过程中肝功水平的检测，血清Citrulline和L- Ornithine、L- arginine三种氨基酸可以共同用于治疗高氨血症等。瓜氨酸的多种生理功能现在已经被普遍应用于医药、食品、保健品、化妆品等多个行业。

科学家们发现，吃西瓜的过程中，瓜氨酸能够通过特定酶转变成精氨酸，深入研究后发现，瓜氨酸在哺乳动物体内有两种存在形式：瓜氨酸化蛋白和游离状态瓜氨酸。游离的瓜氨酸代谢与三种关键酶有关，三种酶分别为：鸟氨酸氨甲酰转移酶(ornithine carbamoyltransferase, OTC)，精氨酸琥珀合成酶(argininosuccinate synthetase, ASS)和一氧化氮合成酶(NO synthase,NOS)。在瓜氨酸的生物代谢途径中这三种酶是交叉分布的。线粒体内，在鸟氨酸氨甲酰转移酶（OTC）催化条件下，氨甲酰基（Carbamoyl）先转移到鸟氨酸的氨基（Amino）上，生成瓜氨酸，然后在精氨酸琥珀合成酶（ASS）催化下代谢生成精氨酸琥珀酸。这一瓜氨酸的代谢过程属于Urea Cycle，即尿素循环。尿素循环可以将NH3和CO2转化成鸟氨酸、瓜氨酸、精氨酸，最终生成尿素，排出体外，也就是可以将体内因为蛋白质代谢而产生的毒性较髙的氨转化为毒性较低的尿素，之后排出体外，达到维持动物血液中的氨浓度稳态的目的。如果尿素循环发生障碍，就会发生血尿浓度升高的情况，从而引起高尿血症。

随着科学家对L-瓜氨酸药理的研究越来越深入，瓜氨酸的需求量也越来越大。瓜氨酸的防止氧化作用效果强烈，所以其能够在食饮品、保健用品、医药用品以及化妆用品等多个行业大放异彩。日前，很多家国内外公司已经抓住这个机会利用 L-瓜氨酸的功能制造出了HIV对抗药物、运用于医学方面地指示剂以及保健用品等产品。从上面的研究一目了然的是， L-瓜氨酸应用前景非常广阔，市场需求量也一路飙升，故开发出应用范围广范、价格适意的 L-瓜氨酸生成方法成为主要的研究方向。

请支付后下载全文，论文总字数：25948字