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摘 要

莱鲍迪甙A(Rebaudioside A，RA甙)是从混合物甜菊糖苷中分离或直接从甜叶菊提取物中纯化出的甜味剂，它不仅热量低，而且相对于甜菊糖苷中其它的几种苷类没有不良的苦味，甜度相当于蔗糖的350-450倍，且具有良好的耐酸碱性和热稳定性，因此现在市场上对其的关注也越来越高。目前应用生物催化技术，在St甙和RA甙上增加特定基团如葡萄糖基（Glc）或果糖基（Fru）单元，提高甜菊糖甙附加品产量，提高产品价值。

本研究通过控制变量法优化培养基条件以缩短重组酿酒酵母的分批培养周期；初步研究酿酒酵母生长代谢，为后期的全细胞催化做技术支持；在已有共表达的UDP-糖基转移酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的重组酿酒酵母YPH499 (pESCD-UGT-UGPase)基础上，建立重组酿酒酵母YPH499(pESCD-UGT-UGPase)生长状态；以低品质甜菊糖为底物，考察重组菌催化生成莱鲍迪甙A的反应条件，为工业应用作技术上的指导。

关键词：甜叶菊 莱鲍迪甙A 重组酿酒酵母 UDP-糖基转移酶 全细胞催化

Study on the catalytic synthesis of Rebaudioside A by low quality Stevia glycoside

ABSTRACT

Rebaudioside A is the sweetener from the mixture of Stevioside separation or directly from the purify of the Stevia extract. It is not only low in calories, and with respect to the bitter taste of Stevioside bitterness in several other glycosides no adverse, sweetness equivalent to 450 times that of sucrose and with good acid and alkali resistance and thermal stability, so now the attention from the market is also more and more high. The application of bio catalytic technology, in St glucoside and Ra glycoside increased specific groups such as glucose (GLC) Radical or fructosyl unit (FRU), to get high Stevioside product yield and high product value.

This Study from the control variables method to optimize the medium conditions to shorten the recombinant Saccharomyces cerevisiae batch culture cycle. Preliminary Study on growth and metabolism of Saccharomyces cerevisiae and technical support to the late whole cell catalysis; enzyme and UDP glucose pyrophosphorylase recombinant Saccharomyces cerevisiae YPH499 pESCD-UGT-UGPase in existing co expression of UDP glycosyl transfer, the establishment of a recombinant Saccharomyces cerevisiae YPH499 (pESCD-UGT-UGPase) growth; to the low quality of stevia as substrate. The effects of reaction conditions of recombinant bacteria catalyzes the formation of Rebaudioside A, for technical guidance of industrial applications.

Key words: Stevia; Rebaudioside A; Recombinant saccharomyces cerevisiae; UDP- glycosyl transferase; Whole-cell catalysis

目 录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 甜菊糖的概述 1

1.2 莱鲍迪甙A 3

1.2.1 莱鲍迪甙A的分离检测方法 3

1.2.2 莱鲍迪甙A生产制备方法的研究进展 3

1.3 酿酒酵母表达系统 5

1.4 立题意义 6

1.5 本论文的研究内容 6

第二章 重组酵母YPH499(pESCD-UGT-UGP)催化甜菊甙合成莱鲍迪甙A 7

2.1 前言 7

2.2 实验材料 8

2.2.1 实验仪器与试剂 8

2.2.2 菌株与质粒 8

2.2.3 培养基 8

2.3 实验方法 9

2.3.1 重组菌生长与残糖量的确定 9

2.3.2 重组菌与对照菌全细胞催化能力比较 9

2.3.3 底物St甙浓度对重组菌全细胞催化合成RA甙的影响 9

2.3.4 柠檬酸钠浓度对全细胞催化合成RA甙的影响 10

2.3.5 葡萄糖的添加方式 10

2.3.6 混合糖底物浓度对全细胞催化合成RA甙的影响 10

2.3.7 色谱分析条件 11

2.4 结果讨论 11

2.4.1 重组菌生长与残糖量的确定 11

2.4.2 莱鲍迪甙A检测 11

2.4.3 重组菌与对照菌全细胞催化能力比较 12

2.4.4 St甙浓度对重组菌全细胞催化合成RA甙的影响 13

2.4.5 柠檬酸钠浓度对全细胞催化的影响 13

2.4.6 葡萄糖的添加方式 14

2.4.7 混合糖底物浓度对全细胞催化合成RA甙的影响 14

第三章 结论与展望 16

3.1 结论 16

3.2 展望及进一步工作的建议 16

参考文献 17

致谢 20

第一章 文献综述

1.1 甜菊糖的概述

甜味剂是一种重要的食品添加剂，在食品工业中拥有巨大的市场。蔗糖作为传统的甜味剂，过度食用会引起龋齿、牙周病等牙齿疾病。近年来，蔗糖还被认为是造成多种慢性疾病包括肥胖症、糖尿病和癌症等的罪魁祸首。随着现代营养学的发展和社会生活方式的变化，人们对无营养和低热量甜味剂的需求逐渐增加。甜菊糖是从甜叶菊中提取用于食品工业中作为非营养性高强度甜味剂，有稳定、高甜度、易容解、耐热、低热能等特点，它的甜度相当于蔗糖的200～300 倍。甜菊糖在人体内不会代谢，几乎没有热量，热值仅为蔗糖的1/300，也不会残留或产生副作用^[1]，不仅如此，实验证明，甜菊糖无毒副作用，无残留，无致癌作用，安全可靠，是一种可替代蔗糖非常理想的甜味剂，另外，还有促进新陈代谢，达到强身健体的作用^[2]。在目前看来，甜菊糖是世界上已发现的和蔗糖口味最接近的天然低热值甜味剂，因此甜菊糖已被誉为“世界第三蔗糖”。

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