论文总字数：20394字

摘 要

1898年霉酚酸（MPA）首次从Penicillin glaucum菌株上分离出来，1995年通过美国FDA批准上市用于治疗器官移植后的排异反应。MPA产品主要分为两种：霉酚酸酯（MMF，商品名CellCept®）和肠溶性霉酚酸片（商品名Myfortic®）。其中，MPA是MMF的活性成分，MMF口服后迅速水解成MPA而产生活性。

随着MPA的日益广泛使用，其毒性也受到愈多的关注，尤其是对孕妇和胎儿的毒性。由于MPA是已知的次黄嘌呤核苷酸脱氢酶（IMPDH）的抑制剂，通过阻断嘌呤核苷酸的合成来发挥免疫抑制作用。我们猜测其毒性机理可能与其抑制嘌呤合成相关。本实验采用了斑马鱼模型对MPA进行毒性研究，主要考察发育毒性，深入探讨其毒性机理，分析其毒性与IMPDH通路的关系。

斑马鱼具有体积小、生殖周期短、生殖能力强、体外受精且胚胎发育透明、其基因与人类基因的相似度达到87％等特点。斑马鱼是一种理想观察药物的致畸毒性模型，是一种用于研究脊椎动物胚胎学和发育遗传学的模式生物。而且拓展和延伸到疾病模型和药物筛选领域。作为一种动物模型, 斑马鱼能够全面地检测评估化合物的活性和副作用, 实现高内涵筛选。

关键词：MPA 斑马鱼 发育毒性

Study on the developmental toxicity of mycophenolic acid in zebrafish embryo

Abstract

MPA was isolated from the penicillin glaucum strains in the 1898 for the first time, which approved by FDA listed for treatment of organ transplant rejection in 1995. MPA products were divided into two kinds: mycophenolate mofetil (MMF, the name of the commodity, Cellcept amp; reg;) and enteric coated mycophenolic acid tablets (trade name Myfortic amp; reg;). Among them, the MPA is the active ingredient of MMF, MMF rapidly hydrolysed into MPA in vivo.

Along with the increasing use of MPA, its toxicity has also attracted more attention, especially for pregnant women and fetal toxicity. As MPA is known of an inhibitor of IMPDH, it exerts the immune inhibition by blocking the synthesis of purine nucleotides. We assumed the the toxic mechanism may be related to the inhibition of purine synthesis. We used the zebrafish model to study the toxicity of MPA, mainly the developmental toxicity, and study its toxicity mechanism and learn the relationship between the toxicity and IMPDH pathway.

The zebrafish has a small volume, short reproductive cycle, stronger ability of reproduction, fertilization in vitro and embryonic development of transparent; it has the similarity with human genes, which reached 87%. Zebrafish is an ideal observation model of teratogenicity, especially for the study of vertebrate embryology and developmental genetic model organisms, and the disease modeling and drug screening. As an animal model, zebrafish can be used to detect compounds for evaluating their activity and side effects.

Key Words: MPA ; Zebrafish ; Developmental toxicity

目 录

摘要 1

Abstract 1

第一章 文献综述 1

1.1斑马鱼模型在生命科学研究中的应用 1

1.1.1 斑马鱼 1

1.1.2 斑马鱼在毒理学研究中的应用 2

1.1.3斑马鱼在生物医药研究中的应用 3

1.1.4 斑马鱼在环境检测中的应用 4

1.2霉酚酸的临床研究和作用机制 5

1.2.1 霉酚酸 5

1.2.2霉酚酸的药代动力学研究 5

1.2.3霉酚酸的毒性研究 5

第二章 利用斑马鱼模型评价MPA的毒性研究 7

2.1 引言 7

2.2 实验材料和方法 7

2.2.1 霉酚酸 7

2.2.2 斑马鱼的饲养 7

2.2.3 主要试剂和耗材 8

2.2.4 主要仪器 8

2.2.5 评价霉酚酸对斑马鱼胚胎的毒性评估 9

2.2.6 qRT-PCR实验 10

2.3 数据分析 13

2.4 结果与讨论 13

2.4.1霉酚酸急性毒性和发育毒性结果 13

2.4.2 霉酚酸作用造成斑马鱼胚胎的发育缺陷 13

2.4.3 qRT-PCR实验结果 14

2.4.4 讨论 15

2.4.5 结论 16

参考文献 17

致谢 20

第一章 文献综述

1.1斑马鱼模型在生命科学研究中的应用

1.1.1 斑马鱼

1.1.1.1 斑马鱼的简介

斑马鱼( Danio rerio )，又称蓝条鱼、花条鱼、印度鱼，主要分布于孟加拉国、印度、巴基斯坦等水域的一种小型热带鱼。斑马鱼体长为4~ 6 cm，身体延长而略呈纺锤形，背部呈橄榄色，体侧从鳃盖后到尾末有数条银蓝色纵纹，臀鳍部有与体色相似的纵纹，尾鳍长而呈叉形。由于斑马鱼养殖方便、繁殖周期短、产卵量大、体外受精、胚胎透明等优点^[1]， 很快成为分子发育生物学、遗传学、环境毒理学等学科的模式动物。斑马鱼与人类基因有着87%的高度同源性^[2]，这意味着其实验数据大多数情况下也适用于人体，因此受到生物学家的重视。

1.1.1.2 斑马鱼的管理

最适宜斑马鱼生长和繁殖的温度位28.5 ℃ ^[3]。斑马鱼对水质的要求一般为弱碱性（pH值7- 8），实验室养殖的水体中需充氧来保证斑马鱼的正常发育。喂食方面，每次的投喂量以斑马鱼在2 min 内吃完为宜，每天2-3次。为了保证斑马鱼生长和繁殖正常，每天最好活食与人工合成的饵料相结合投喂。正在产卵的斑马鱼，需要每日至少喂一次如丰年虫之类的活食。如果水质不好， 斑马鱼容易出现细菌感染，如烂鳃、脱鳞、竖鳞和皮肤充血发炎等。生病的斑马鱼应该及时捞出，避免影响其他正常的斑马鱼。在日常养殖过程中，鱼网、产卵盒等在用完后要先用水洗净，然后84消毒液浸泡消毒，晾干，以备下次使用。鱼缸每半个月清洗一次，并用75%的乙醇消毒。

1.1.1.3 斑马鱼的培养

斑马鱼属于卵生鱼类，4月龄进入性成熟期， 5-6月龄的斑马鱼可以进行繁殖。平时饲养时，雌雄斑马鱼分开，需要繁殖产卵时，按1∶2比例将雌雄斑马鱼放入产卵盒中，通过控制光照周期为黑夜/白天14∶10h来产卵。每次光照开始时，斑马鱼即开始追逐产卵，产卵一般在开灯后半小时内结束。结束后将斑马鱼捞出， 雌雄分开饲养。避免连续捞同一条鱼进行产卵。

收集受精卵进行清洗，挑出发白的死卵，洗好的卵放置于0.2 g/L的海盐水中，最后放入28.5 ℃的恒温培养箱中培养。

1.1.2 斑马鱼在毒理学研究中的应用

1.1.2.1 在发育毒理学中的应用

近年来， 斑马鱼日益成为遗传和发育毒理学研究中非常热门的脊椎动物模型。与传统动物模型相比，其能迅速形成完整的循环系统，因此在血管^[4]和心脏^[5]发育毒理学的研究中具有特殊的意义。同时，斑马鱼具有学习、记忆、群居、昼夜节律等复杂行为，对触觉刺激具有逃避反射^[6]。使用斑马鱼模型研究神经发育毒理学可以研究神经系统疾病的发病机制。斑马鱼幼鱼透明易于染色和观察骨骼发育，以斑马鱼为模型的骨骼研究^[7]也逐渐成为热点。

1.1.2.2 在病理毒理学中的应用

斑马鱼为研究人类疾病相关的病理毒理学提供了有效的方法。通过适当的基因学操作，可以将斑马鱼基因用于单倍体、三倍体和四倍体^[8]，这些突变体可以帮助解释在毒物引起的疾病过程中一些特异性基因及相关信号通路的变化。目前在病理毒理学中，斑马鱼主要被应用在免疫系统、神经系统、心血管系统等领域。Zhang^[9]等利用斑马鱼模型进行实验发现，除了已知的几种异生物质代谢基因之外，许多功能不同的代谢基因，如ELOVL脂肪酸延长酶，DNA导向的RNA聚合酶和羟化类固醇脱氢酶在加入化学物质后雌雄不同的斑马鱼基因表达变化是不同的。而且发现在不同的时间段摄入化学物质，雌雄斑马鱼的基因和信号通路的表达也不同。这种现象阐明了在许多生物研究中特别是毒理学和病理学研究中，考虑性别因素的重要性。

1.1.2.3 在药物毒理学评价中的应用

斑马鱼胚胎早期是透明的，能同时分析多个器官及组织；可以在体外发育，能直接观察各器官及组织的发育过程；给药方式简单，胚胎能自行吸收水中的小分子化合物。鉴于这些特性，使得评价胚胎毒性及畸形效应变得比较简单。目前，斑马鱼已经成为最有前途的毒理学研究模式脊椎动物^[10]。

1.1.2.4 在环境毒理学评价中的应用

90年代初，斑马鱼开始被用于混合化学物的检测及其中一种化学物相对其它化学物的生物累积效应的研究。利用斑马鱼对一系列环境毒物包括致癌物进行短期及长期的暴露效应研究都比较方便。环境毒物的慢性生物学效应鉴定可使用斑马鱼的整个生长抑制情况、生殖毒性以及发育命期试验以检测死亡率、毒性和神经行为毒性。

1.1.3斑马鱼在生物医药研究中的应用

1.1.3.1研究生物分子对血脑屏障的通透性

血脑屏障 (blood-brain barrier, BBB)，指在血管和脑之间的一种选择性地阻止某些物质由血液进去脑的屏障，这一特性也使中枢神经系统疾病的根治变得棘手。血脑屏障对外界物质具有严格的通透性限制，能够阻止某些物质（大部分是有害物质）由血液进入脑内。这也为治疗一些恶性肿瘤和神经系统疾病加大了难度^[11]。血脑屏障通透性的研究最重要的就是实验模型的选择。目前研究用的主要有体内体外两种模型。哺乳动物BBB 的体内模型存在操作繁琐、实验条件不易控制等缺点；而单层脑微血管内皮细胞 (BMEC) 与星形胶质细胞 (AC) 共培养方式的体外BBB 模型中，存在价格昂贵、操作复杂，与体内环境差异大等弊端^[12]。

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