论文总字数：15997字

摘 要

固定化脂肪酶是指通过化学或物理的方法与某物体结合制备成为不溶于水但仍具有催化活性的结合体，这个过程将原本游离的脂肪酶固定在某物体上使之成为复合脂肪酶催化剂。现在我们所使用的催化剂存在使用寿命短、固定化效率低的缺点，所以合成一定的多肽来优化催化剂的功能是很有必要的，我们打算利用固相合成多肽结合在树脂上来进行优化改良，选用氨基树脂，利用多肽合成技术，在树脂表面偶联疏水性的多肽链，通过疏水结合的方式固定化脂肪酶，提高脂肪酶的固定化效率和使用寿命等。

【关键词】 固定化脂肪酶 多肽 固相合成

For peptide synthesis resin immobilized lipase

Abstract

Immobilized lipase is through chemical or physical means combined with an object prepared to become insoluble in water but still has the combination of catalytic activity, this process will be the original free lipase fixed making composite lipase catalyst on an object . Now we use the presence of a catalyst life is short, low efficiency shortcomings fixed, so to optimize the function of the catalyst synthesis of certain peptides is necessary, we intend to make use of solid-phase peptide synthesis resin bound up to optimize the improvement, selection amino resins, the use of polypeptide synthesis techniques, coupled to a surface of the resin hydrophobic polypeptide chains, through a combination of hydrophobic immobilized lipase, to improve the efficiency of the immobilized lipase, and longevity.

Key words : immobilized lipase ; peptide; solid phase synthesi

目 录

第1章 前 言 1

1.1脂肪酶概述 1

1.1.1脂肪酶 1

1.1.2脂肪酶的固定化方法及优缺点 1

1.2 多肽的概述 2

1.3 多肽的合成 3

1.3.1 多肽合成的基本原理 3

1.3.2 多肽合成发展简史 3

1.3.3 多肽合成方法 3

1.3.4 固相多肽合成的分类 4

1.3.5 固相多肽合成中常用的树脂 4

1.3.6固相合成基本步骤 5

1.3.7 固相合成中的副反应 6

1.4多肽固相合成在固定化脂肪酶的研究 7

第2章 多肽固相合成的研究 9

2.1实验部分 9

2.1.1 器材与试剂 9

2.1.2 实验方法 10

2.1.3 标准曲线的绘制 11

2.1.4 以DEG AM- resin为固相载体合成多肽 12

2.2实验结果和讨论 15

第3章 结论与展望 16

3.1 主要结论 16

3.2 工作展望 17

参考文献 18

致谢 20

第1章 前 言

1.1脂肪酶概述

1.1.1脂肪酶

脂肪酶是生物体中非常重要的用于代谢的酶，于1834年被发现。在有机相和油水界面产生作用，有十分好的立体选择性，在聚合过程中以长链脂肪酸酯作为天然底物保持单体上的活性基团。自1986年开始，Klibanov等^[1]科学家打破传统思想限制，在界面酶学和非水酶学方面取得重大的研究进展，使得脂肪酶在食品、化学、医药、污水处理等方面得到广泛的应用。有机相反应中，脂肪酶能催化酯的合成、交换和聚合反应，还有肽合成和酰胺合成的反应。其优势在于常温常压下能得到其他方法不能得到的产物。另外，脂肪酶还具有成本低、来源广泛、环保效率高、催化底物多，催化功能多、环保高效等优点。

选用载体^[2]时，以核苷酸锆纳米颗粒为载体，或一些天然物质如活性炭、丝瓜络、硅藻土或以一些高分子单体如苯乙烯、壳聚糖、丙烯酰胺等聚合制备载体，这样制备的载体在固定化脂肪酶时效果很普通，分离时还要采取重力沉降、过滤、抽滤，甚至离心等耗时耗力的操作，工艺流程十分长，不利于工业实际运用。在固定化脂肪酶的方法^[3]上，采用吸附法、包埋法等比较保守的固定化方法，导致所制备的固定化脂肪酶容易脱落、解吸附，而包埋法固定化脂肪酶应用上限制较大，不利于酶与底物的结合，从而催化效率低。由吸附法制备的固定化酶重复使用较差，活力下降教快。

1.1.2脂肪酶的固定化方法及优缺点

脂肪酶固定化的方法^[4]一般分为物理法和化学法。物理法包括包埋法和吸附法，化学法包括共价结合法。

吸附法包括物理吸附法和离子交换法。

物理吸附法师通过范德法力将酶蛋白吸附到不溶于水的载体表面上达到固定化的目的，但是范德华力等作用力很弱，使得作用时酶蛋白的活性中心不容易

被破坏，酶的结构不容易发生变化。但这也使得酶和载体之间的作用十分微弱，导致吸附的酶容易从载体表面脱落下来。

离子交换吸附法则将作用力变为离子效应，即将酶固定到具有离子交换基团的不溶于水的载体上。其优点在于实验条件温和，固定化酶损失的酶活较少。但是也存在作用力弱的缺点。

包埋法^[5]是用凝胶形成的网格或者半透膜聚合成的超滤膜来包裹酶蛋白使其固定化。包埋法相对简洁，使用惰性材料为载体，通常不会和酶蛋白发生反应使得酶的高级结构不会发生变化，并且酶活保持的很好。因此可以用于多种酶的固定化反应。其缺点在于只有小分子才能透过高分子网格或者微囊，所以此法仅适用于小分子量的底物和产物的催化反应。

酶以共价键结合于载体上即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法叫共价结合法。结合过程中有载体共价结合和非载体共价结合^[6]。其优点是此法形成的结合物的酶与载体之间结合十分牢、不容易脱落，并且可以连续使用很长的时间，但是缺点也很明显，反应条件苛刻、操作过程复杂、酶的回收率很低，而且有时候酶的底物专一性也会发生变化。并且酶的空间结构也会发生变化，导致酶的活性中心受到破坏。综上所述应用此法操作重复性差，并不是每次都能得到高活性的固定化酶。

1.2 多肽的概述

肽是蛋白质水解的中间产物，是由α-氨基酸以肽键连接而成的化合物。在20世纪被发现。通常我们称两个氨基酸脱水缩合连接而成的肽叫做二肽，以此类推直至九肽。那么10-100氨基酸缩合而成的化合物叫多肽，它们的分子量低于10,000Da，可以透过半透膜，而且不被三氯乙酸及硫酸铵沉淀。也有文献^[7]将2-10个氨基酸脱水缩合而成的肽称为寡肽或小分子肽；10-50个氨基酸组成的肽称为多肽；而50个以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白质。也就是说有时候蛋白质有时被称为多肽，多肽也可以简称为肽。通常多肽分为^[8]生物活性多肽和人工合成多肽两种。

1.3 多肽的合成

1.3.1 多肽合成的基本原理

在多肽中有一些特殊基团，我们将使用合适^[9]的保护基进行偶联反应把这些不需要反应的氨基或者羧基保护起来。需要继续增加肽链长度的时候，可以使用适当的试剂脱先保护基团，再和新的C端或者N端的氨基酸进行偶联，直到肽链延长得到目标多肽。合成的目的是为了提高脂肪酶固定化所使用的催化剂^[10]的使用寿命和固定化效率，来实现其使用价值。

1.3.2 多肽合成发展简史

在20世纪初Fischer第一次合成含有指定顺序的多肽。在1954年，Vigneaud^[11]合成了一个伟大的产物催产素，自此之后开启了化学合成活性多肽的研究的大门，并且得到快速地发展。1963年Merrifield^[12]用树脂选作固相载体来合成多肽，成功发明了固相合成多肽的基础方式方法。随着时代的进步，很多的具有生物活性的多肽被发现，使得多肽固相合成快速的发展成为一门成熟的技术，缩合所需的试剂、保护基团、反应条件及反应后续处理等很多方面都得到了改进并完善。最近几年多肽合成有得到突破性的发展，可以将几个小分子多肽通过固相和液相结合而连接成较大的肽链，直至得到具有生物活性的物质。

1.3.3 多肽合成方法

多肽合成^[13]分为全化学合成和酶促肽键合成。全化学合成分为固相多肽合成和液相多肽合成。近几年固相多肽合成占据着主导的地位，主要归功于他使用了洗涤、过滤等分离技术使得反应中间产物和最终产物得到纯化。相反传统的液相合成就没有这么高效简洁，因此固相多肽合成作为一种日趋成熟的技术受到广泛的关注。

固相多肽合成的主要设计思路^[14,15]就是先将需要合成的多肽的C末端的氨基酸的羧基共价结合在一个不溶性的高分子树脂上，然后以这个结合在固相树脂上的氨基酸作为目标多肽的开端，经过先脱氨基保护基再和过量活化羧基组分反就可以延长肽链，重复以上步骤，也就是缩合-洗涤-脱保护-洗涤-缩合，直到合成目标多肽。事实上，固相多肽合成反应不是在固体物质的表面上进行的，而是由于在高聚物分子中渗入大量溶剂分子而堆积形成的类似凝胶的基体内进行反应的，或者说其反应过程是在一种高度流动且几乎类似溶液的环境里进行的。

1.3.4 固相多肽合成的分类

在最近几十年的发展^[16-18]看来，多肽固相合成分为两种类型。①Merrifield固相合成，也就是Boc固相合成。②Atherton和Shepard所开发的Fmoc固相合成法。两种方法的差别在于保护基不同，分别以Boc-和Fmoc-为保护基团保护α氨基酸，逐渐完成肽链的延长，但是Fmoc固相合成是脱Fmoc保护基和切割产物时所需的条件相对温和，并且其副反应相对于Boc固相合成要少的多，因此Fmoc固相合成以及在研究中被广泛使用。本实验所采用的实验方法就是Fmoc固相合成法。

1.3.5 固相多肽合成中常用的树脂

随着科技的进步，在固相合成中载体有多种类型^[19,20]，就连接方式可以分为醇键连接型、酯键连接型和酰胺键连接型，在不同的溶剂中有溶胀性能不同，有的在极性溶剂中溶胀性能好，有的在非极性溶剂中溶胀性能好。

请支付后下载全文，论文总字数：15997字