论文总字数：22391字

摘 要

本论文以提取鼠李糖脂为目的，利用胜利油田提供的菌株为研究材料，通过16S rDNA序列鉴定来进一步确定其菌株种类，再针对菌种产量低、成本高的问题，进行培养基组分和发酵条件优化，得到最佳培养基配方和发酵条件。然后用酸沉降法和有机溶剂萃取法对发酵液进行分离提取，得到粗产物，采用蒽酮硫酸法对粗产物进行定量分析，采用两步展开薄层层析法（TLC)和高效液相-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）进行定性分析。主要研究结果如下：

16S rDNA序列鉴定该菌株为铜绿假单胞菌；用TLC法初步分析菌株产生物为鼠李糖脂，经HPLC-ELSD分析后，与标准品出峰时间一致，产物主要由2种鼠李糖脂同系物组成。进行优化实验后，最佳的产鼠李糖脂的培养基组成为：棉籽油 21.77g/L，KH₂PO₄ 2.80g/L，NaNO₃ 4.00g/L，K₂HPO₄ 11.40g/L，MgSO₄ 0.48g/L，接种量 1.60%。鼠李糖脂产量为2.96 g/L。发酵条件为：温度37℃，发酵5天，摇床转速为200 rpm。

关键词：生物表面活性剂 鼠李糖脂 铜绿假单胞菌 鉴定

The identification of surface active substance and composition analysis in biosurfactant production generated from bacteria

Abstract

The aim of this paper is to extract the rhamnolipids. Firstly, we should separate and identify strains from shengli oil feild through 16S rDNA sequences identification. Secondly, accroding to the problem of low production and high cost. In order to get the best composition of culture medium and the fermentation conditions, we use the method of shake flask fermentation culture, Finally, the raw product was sperated and purified by acid precipitation and organic solvent extraction. We use the method of anthracene ketone sulphuric acid for quantitative analysis, and use the method of thin layer chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography-Evaporative Light Scattering Detector(HPLC-ELSD) for qualitative analysis.

The result showed that the strain is a pseudomonas aeruginosa. We concluded that its products are the rhamnolipids by TLC and HPLC-ELSD analysis, which is in accordan-ce with standard peak time, so the crude rhamnolipids contain two kinds of rhamnolipids homologue. The best composition of culture medium for rhamnolipids production as fol-lows: cottonseed oil 21.77g/L, KH₂PO₄ 2.80g/L, NaNO₃ 4.00g/L，K₂HPO₄ 11.40g/L， MgSO₄ 0.48g/L. The inoculation was 1.60%. The production of rhamnolipid is 2.96 g/L. The cultures were grown in an incubated gyratory shaker at 37℃ and 200rpm for 5 days.

Keyword: biosurfactant；rhamnolipids；pseudomonas aeruginosa；identification

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1表面活性剂 1

1.1.1 生物表面活性剂的简介及来源 1

1.1.2 生物表面活性剂的性质及特点 1

1.1.3生物表面活性剂的分类及来源 2

1.2鼠李糖脂表面活性剂 3

1.2.1 鼠李糖脂的概述 3

1.2.2 鼠李糖脂的化学分子结构 3

1.2.4 鼠李糖脂的实际应用 4

1.3 鼠李糖脂的生物合成 4

1.3.1 培养基对鼠李糖脂发酵生产的影响 5

1.3.2 环境条件对鼠李糖脂发酵生产的影响 6

1.4 本文的开展思路与研究意义 6

第二章 产生物表面活性剂菌株的鉴定 7

2.1 实验材料 7

2.2鉴定方法与步骤 7

2.2.1 细菌 16S rDNA 片段的扩增 7

2.2.2 16S rDNA PCR片段与载体连接 8

2.2.3 连接产物转化大肠杆菌DH5α 8

2.3菌落特征 9

2.4鉴定结果 10

2.4.1 16S rDNA 片段的扩增 10

2.4.2 系统发育树的建立 11

第三章 鼠李糖脂的生产发酵条件的优化实验 12

3.1 实验试剂与器材 12

3.1.1实验试剂 12

3.1.2实验仪器 12

3.2 实验材料 12

3.2.1菌种来源 13

3.2.2培养基 13

3.3 实验方法与过程 13

3.3.1鼠李糖脂标准曲线的制作 13

3.3.2样品的测定 13

3.3.3培养基及发酵条件的优化 14

3.4 结果与讨论 14

3.4.1 实验结果 14

3.4.2 实验结论 17

第四章 鼠李糖脂的分离鉴定及活性组分初步分析 19

4.1 实验试剂与器材 19

4.1.1 实验试剂 19

4.1.2 实验器材 19

4.2 实验方法与过程 20

4.2.1 产物的分离提取 20

4.2.2 产物分析 20

4.3 结果与讨论 21

4.3.1 TLC分离生物表面活性剂 21

4.3.2表面活性组分的鉴定 21

第五章 总结与展望 23

5.1 总结 23

5.2 展望 23

参考文献 24

致 谢 26

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