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摘 要

丙酮丁醇梭菌能够使用葡萄糖、五碳醛糖、果胶糖、纤维二糖等多种原料，通过发酵这些糖得到丙酮、丁醇、乙醇等产物，是一种良好的木质纤维素同步糖化发酵菌种。

本实验通过对丙酮丁醇梭菌进行基因敲除，通过PCR扩增及产物序列分析来获得成膜能力较差的菌株。实验通过采用ClosTron技术，对二型内含子插入片段进行改造，构建PMTL007C-E2重组质粒，并且失活丙酮丁醇梭菌的潜在生物膜多糖合成基因，来验证对丙酮丁醇梭菌的生物膜多糖有影响的基因。同时需要进一步完成所得基因工程菌株的发酵考查和生理形态表征。本实验中用葡萄糖溶液作为碳源，给丙酮丁醇梭菌提供生长所需的能量，并通过显微镜观察菌株的形态特征。

关键词：丙酮丁醇梭菌 生物膜 多糖 生理形态表征

Abstract

Clostridium acetobutylicum can use glucose, xylose, arabinose, cellobiose, and other substrates, fermentation of sugars obtained acetone, butanol, ethanol and the like product, it is an excellent simultaneous saccharification and fermentation of lignocellulosic species.

The experiment conducted by Clostridium acetobutylicum knockout to get a good film-forming ability of the strain was amplified by PCR and sequence analysis of the product.By using ClosTron experimental technique,transform group Ⅱ intron inserted fragment,construt a plasmid named PMTL007C-E2,and inactivation of C. acetobutylicum potential biofilm polysaccharide synthetic genes, gene to verify the impact of C. acetobutylicum biofilm polysaccharides.At the same time we need to further complete examining the fermentation morphological and physiological characterization of genetically engineered strains.The experiment using a solution of glucose as carbon source for the growth of Clostridium acetobutylicum providing the energy required, their morphological characteristics of the strain through a microscope.

Keywords: Clostridium acetobutylicum; biofilm; polysaccharide; Physiological characterization

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 生物膜的相关内容 1

1.1.1 生物膜的发现 1

1.1.2 生物膜的形成过程及其功能 1

1.1.3 生物膜形成过程中有关多糖 3

2.1 丙酮丁醇梭菌的相关内容 5

2.1.1 丙酮丁醇梭菌的定义 5

2.2.2丙酮丁醇梭菌中的基因失活策略 6

第二章 丙酮丁醇梭菌CA_C0734基因失活 7

2.1 材料与方法 7

2.1.1 菌种与质粒 7

2.1.2 培养基与缓冲液 7

2.1.3 菌株培养方法 8

2.2 试剂及仪器 8

2.2.1 工具酶和试剂盒 8

2.2.2 实验仪器 9

2.2.3 实验试剂 10

2.3 载体的构建 11

2.3.1 pMTL007C-E2重组质粒的构建 12

2.3.2 大肠埃希氏菌转化(热击法) 12

2.3.3 pMTL007C-E2重组质粒的甲基化 12

2.3.4 大肠杆菌中质粒的提取 13

2.4 丙酮丁醇梭菌的电转化的制备和转化 14

2.5 突变体检测方法 15

2.5.1 菌落PCR验证 15

2.5.3 连T载体测序 17

2.6 结果 18

2.6.1 菌落PCR验证结果 18

2.6.2 T载体测序结果 19

本章小结 21

第三章 考察野生菌株与基因敲除菌株在成膜能力上的差异 22

3.1 固定化发酵期间细胞成膜的特性分析 22

3.3.1 上罐前的准备工作 22

3.3.2 更换培养液 23

3.3.3 取样和检测 23

3.2 野生菌与敲除菌菌落形态的比较 23

3.2.1培养基 23

3.2.2实验方法 23

3.3 结果与讨论 23

3.3.1野生菌与敲除菌在固定化条件下培养十批次后生物膜形成情况 23

3.3.2通过在显微镜下查看固定化细胞的形态特征 24

3.3.3野生菌与敲除菌吸附固定化的发酵结果比较 24

3.3.4野生型菌株与敲除菌株的菌落形态特征 25

本章小结 26

参考文献 27

致谢 30

第一章 文献综述

1.1 生物膜的相关内容

1.1.1 生物膜的发现

生物被膜又称生物膜是在生物或非生物介质表面由微生物及其胞外基质形成的致密、复杂的生物聚集体^[1]。在地球上，生物膜是最为寻常的微生物存在形式之一，大于90%的细菌是以生物膜的形式存在^[2]，大于80%的细菌性传染疾病和生物膜有关。我们生活的周围到处都可以发现生物膜的踪迹，比如树木表面覆盖的各种菌斑，石质文物表面和岩石样品中的微生物菌落，牙釉质表面的菌斑生物膜等。早在1683年，荷兰显微镜学家列文·虎克在寄往英国皇家学会的信中写到其利用自制的显微镜对牙菌斑里的微生物进行了观察和描述，这是最早由关细菌生物膜的科学研究^[3][4]。之后生物膜研究进行缓慢，直到1978年Costerton等才首次提出生物膜的相关理论^[5]，20世纪70年代末生物膜作为独立学科获得了快速发展。Montana State University在十九世纪九十年代建立了全世界首个生物膜生物工程实验中心，而在一年后，John R.Lawrence等人在加拿大国立水环境研究所首次阐述了细菌生物膜的三维立体结构^[6]。现如今，随着人们逐渐意识到生物膜在细胞感染疾病中的重要影响及在工业生产中展现出的优良特性，国内外研究者对于生物膜的研究和发展越来越重视。

1.1.2 生物膜的形成过程及其功能

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