论文总字数：23693字

摘 要

本课题采用传统育种手段，通过三级筛选的方法，筛选出在了一株在42℃下有较强生长能力的酵母菌株，通过26S rDNA菌种鉴定系统鉴定后确定筛选得到的酵母菌株的种属是毕赤酵母，并命名为Pichia kudriavzevii NCY27。

NCY27有较强的耐糖性和耐热性，可以在42℃的高温下和35%的初始糖浓度的条件下正常生长，热致死温度亦达到了62℃，NCY27生长和新陈代谢速度快，最适pH5.0，在最低3.0的pH下亦可以生长，具有耐高温的和耐高糖的特性，是一株具有良好应用价值的酵母菌株。

耐高温酵母菌株NCY27在高温条件下培养，胞内海藻糖含量激增，在37℃和40℃条件下达到了152.37mg/g和326.19mg/g，与30℃相比分别上升了32.25%和183.3%；酵母细胞总麦角固醇和游离麦角固醇也迅速上升，含量达到了19.8mg/g、32.6mg/g、42.7mg/g和3.42mg/g、5.89mg/g和6.97mg/g，比30℃下培养检测后得到的总麦角固醇和游离麦角固醇分别上升了35.1%和52.9%；40℃下分别上升了56.7%和83.7%。由此可见，海藻糖和麦角固醇对NCY27耐热性起着极其重要的作用。

关键字：毕赤酵母 耐热性 海藻糖 麦角固醇

Screening and Character of a thermotolerant yeast

ABSTRACT

This project with traditional breeding methods, screened out a yeast strains having fermentative capability in 42 ℃ through three level screen, which was confirmed that its specie was pichia pastoris by species identification system, and named after Pichia kudriavzevii NCY27.

NCY27 has strong sugar tolerance and heat resistance, and can grow normally at a high temperature of 42 ℃ and initial sugar concentration of 35%, and pyrogenic die temperature has reached 62 ℃. NCY27 has fast growth and metabolism, pH 5.0 perfect for grow which can grow in lowest pH for 3.0. A yeast strains with high temperature properties and resistance to high sugar has good application value.

Cultivating NCY27 under high temperature conditions, intracellular trehalose content increased quickly, reached to 152.37mg / g and 326.19mg / g respectively at 37 ℃ and 40 ℃, which rose by 32.25% and 183.3% respectively compared to 30℃. Total ergosterol and free ergosterol in yeast cell are also rising rapidly, and the contents are 19.8mg/g, 32.6mg/g, 42.7mg/g, and 3.42mg/g, 5.89mg/g, 6.97mg/g, rising by 35.1% and 52.9% respectively compared to 30℃, and rising by 56.7% and 83.7% respectively compared to 40℃. This shows that trehalose and ergosterol play an important role in the heat resistance of NCY27.

Keywords: pichia pastoris heat resistance trehalose ergosterol

目录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 研究背景 1

1.1.1 燃料乙醇简介 1

1.1.2 国外燃料乙醇的发展现况 1

1.1.3 国内燃料乙醇的发展现状 2

1.1.4 燃料乙醇发展面临的问题 2

1.1.5 耐高温酵母的简介 3

1.2 耐高温酵母乙醇发酵的研究 3

1.2.1 耐高温酵母的育种 3

1.2.2 燃料乙醇生产工艺的研究 4

1.3 影响酵母耐高温性能的因素 4

1.3.1 海藻糖 4

1.3.2 热休克蛋白 5

1.3.3麦角固醇 5

第二章 实验过程 6

2.1 实验器材 6

2.1.1 实验材料 6

2.1.2 培养基 6

2.1.3 主要仪器 6

2.1.4 主要试剂 7

2.2 试验方法 8

2.2.1 菌株的筛选 8

2.2.2 菌株的保藏 8

2.2.3 菌株的耐受性鉴定 9

2.2.4 不同温度条件下酵母菌株生长曲线测试 10

2.2.5 酵母菌的26S rDNA基因序列鉴定 10

2.2.6 海藻糖的提取与含量测定 11

2.2.7 麦角固醇的提取含量测定 11

第三章 结果与讨论 13

3.1 酵母菌的筛选 13

3.1.1 一级筛选 13

3.1.2 二级筛选 13

3.1.3三级筛选 14

3.2菌株的菌种鉴定 15

3.2.1酵母菌的26S rDNA基因序列鉴定结果 15

3.3酵母性能测试 15

3.3.1耐热性 15

3.3.2耐糖性 16

3.3.3 耐酸性 17

3.3.4耐醇性 18

3.3.5致死温度 18

3.3.6菌株在不同温度下的生长状况 19

3.3.7海藻糖含量测定结果 19

3.3.8麦角固醇含量测定结果 21

第四章 结论与展望 23

4.1结论 23

4.2展望 23

参考文献 25

致谢 28

第一章 文献综述

1.1 研究背景

1.1.1 燃料乙醇简介

当今世界，随着环境污染的不断加重和资源危机的不断凸显，利用可再生资源来取代不可再生资源的需求日趋紧迫。因而，不可再生资源的利用和推广受到了越来越多国家的关注。中国现在已经成为了世界上最大的能源消耗国，也是世界第二大的石油进口国，随着对能源安全保障的需求，对可再生能源的需求变得越来越迫切^[1]。与此同时不可再生能源燃烧造成的全球变暖问题，使可再生的环境友好型生物能源需求大量增加。目前，燃料乙醇和生物柴油已经成为世界上应用范围最广，使用量最大的生物燃料^[2]。

乙醇，又被称作为酒精，分子式为C₂H₅OH，现通常以糖质，淀粉质和纤维质作为原料来生产乙醇^[3]。通过发酵来生产乙醇是目前世界上最常用的一种乙醇生产方式。目前世界上70%以上的乙醇被作为燃料使用^[4]。乙醇作为一种清洁的可再生能源，已经引起了越来越多人的重视。利用乙醇来作为燃料或者作为燃料添加剂已经成为了解决世界能源问题的一个重要途径。最普遍的使用方法便是作为汽油添加剂，将乙醇进一步脱水后，以10%的比例加入汽油中及可得到乙醇汽油。乙醇汽油中的乙醇可以代替四已基铅和MTBE(甲基叔丁基醚)等燃油添加剂，可以增加含氧量从而提高燃料在发动机内的燃烧效率，减少尾气排放从而实现减少对环境的污染^[5]。同时作为一种有机溶剂，乙醇汽油中的乙醇还可以有效的减少油路积炭，提高燃油输出效率。随着燃料乙醇作为一种可再生能源的前景变得愈发广阔，燃料乙醇产业必将成为受到重点培育和发展的战略性新兴产业项目^[6]。

1.1.2 国外燃料乙醇的发展现况

目前燃料乙醇的使用已经十分广泛，并成为了最重要的汽油添加剂，产量和使用量均十分巨大。2014年全球乙醇总产量达到了9190万立方米，美国，巴西和中国是世界前三的乙醇生产国家。产量居首位的是美国达到了5450万立方米，

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