论文总字数：24524字

摘 要

番茄红素（lycopene）是一种不含氧的类胡萝卜素，主要存在成熟番茄中。1873年Hartsen首次把这种红色晶体从浆果薯蓣中分离出来。目前常见生产番茄红素方法有3种：化学合成法、微生物发酵法、天然提取法。本课题研究利用分子生物学方法将番茄红素合成的关键基因构建质粒，构建出能生产番茄红素的大肠杆菌基因工程菌株，并进行亚克隆及发酵等工作，我们从后期质粒转化开始做了30组对照试验用控制变量法探究光照对番茄红素产率的影响以及最佳时间积累量。从实验数据上显示在光照条件下番茄红素的含量远远低于暗培养条件下的番茄红素含量，其中质粒99a-EBI导入大肠杆菌BL21（DE3）后在暗培养条件下发酵40h具有最大番茄红素产量826.45μg/g。无论在光培养还是暗培养条件下，番茄红素含量在40h达到最大值，之后随着时间的增加番茄红素产量逐渐下降。本论文通过研究大肠杆菌中的异源合成番茄红素过程关键基因在不同质粒及宿主中的影响，可用于基因改造或代谢工程改造以进一步提高大肠杆菌工程菌高产番茄红素能力。

关键词：番茄红素 基因工程 微生物发酵法 质粒 多酶表达

ABSTRACT

Lycopene (lycopene) is a kind of non - oxygenated carotenoids, which mainly exist in mature tomato. In 1873 Hartsen first to separate the red berries from the crystal yam. At present, there are 3 kinds of common methods: chemical synthesis, microbial fermentation, and natural extraction. This paper studies using molecular biology methods tomato red pigment synthesis key gene plasmid and construct a lycopene production of genetically engineered E.coli strains and subcloning and fermentation, we from the late plasmid transformation began to do 30 group, sham controlled trial with control variables method to explore the light of lycopene yield were investigated and optimum time of accumulation. From the experimental data on display in the light conditions of lycopene content is far below the dark culture conditions of lycopene content. The plasmid 99a-EBI into Escherichia coli BL21 (DE3) after cultured in the dark under the conditions of fermentation 40H has the largest tomato red pigment production 826.45 UG / G. Under the condition of light culture and dark culture, the content of lycopene in 40H reached the maximum value, and then decreased with the increase of time. In this paper through the study of Escherichia coli heterologous synthetic lycopene pigment of key genes in the different plasmids and host effects, for gene transformation or metabolic engineering to improve engineered Escherichia coli high yield of tomato red element ability.

KEYWORDS: Lycopene; genetic engineering; Microbial fermentation; plasmid；Multi enzyme expression

目 录

摘 要 II

ABSTRACT III

第一章 文献综述 1

1.1 引言 1

1.2 番茄红素的功能 1

1.3 番茄红素的生产方法 2

1.3.1 天然提取法 2

1.3.2化学合成法 2

1.3.3微生物发酵法 3

1.4.基因工程菌生产番茄红素 4

1.4.1利用酵母合成番茄红素 4

1.4.2利用霉菌合成番茄红素 4

1.5 研究意义 5

1.6 研究内容 6

第二章 材料、设备与方法 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 实验器材 7

2.1.2 实验试剂 7

2.1.3 培养基 8

2.1.4 菌株和质粒 9

2.2 实验方法 9

2.2.1 引物设计 9

2.2.4 重组质粒的转化 10

2.2.5菌落PCR鉴定阳性重组子 11

2.2.6挑菌活化 11

2.2.7不同条件下工程菌的培养 11

2.2.8番茄红素提取 12

2.2.9 番茄红素的含量测定 12

第三章 实验结果与讨论 13

3.1 重组质粒的构建 13

3.1.1 EBI片段的扩增 13

3.1.2 菌落PCR验证 13

3.2.1 99a-EBI在光照条件下各宿主的生长情况 14

3.2.2 18-EBI导入不同感受态 15

3.2.3 28a-EBI导入不同感受态 17

3.2.4 22b-EBI导入不同感受态 18

3.3 产番茄红素的最佳组合 20

3.3.1 99a-EBI导入不同感受态番茄红素含量值 20

3.3.2 18-EBI导入不同感受态番茄红素产量 22

3.3.3 28a-EBI导入不同感受态番茄红素产量 23

3.3.4 22b-EBI导入不同感受态番茄红素产量 25

第四章 结论与展望 28

参考文献 29

致 谢 32

第一章 文献综述

1.1 引言

番茄红素是一种深红色晶体， 1873年首次提取出来。1903年正式命名为番茄红素^[1-2]。已经被FAO (联合国粮农组织)、JECFA (食品添加剂委员会)和WHO (世界卫生组织)等组织认定为A类营养素。因其具有多种生理活性功能而广泛被应用于各个生物化工行业。

1.2 番茄红素的功能

1.2.1番茄红素的抗氧化作用

番茄红素是能通过化学和物理方法猝灭的单线态氧。番茄红素能够吸收不同电子激发态的能量，接收光能并通过能量转移过程让单线态氧的能量转到番茄红素，生成三重态番茄红素分子和基态氧分子，三重态番茄红素能通过振动和一系列旋光反应得到再生，并且在此过程中把能量散发；番茄红素的猝灭能力与分子中所含有的共轭双键有关系^[3]。Paolo等1990年报道了生育酚和类胡萝卜素等30余种生物抗氧化剂猝灭单线态氧的作用，而番茄红素是猝灭单线态氧最强的^[4]。

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