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摘 要

D-Lys具有良好的抗真菌性和抗菌性，是新药开发的重要药物中间体，它比L-Lys 更适合在癌症治疗中使用；D-Lys的多聚体则是药物的良好载体，能刺激人脑星形胶质细胞和软骨细胞的增殖。因此，D-赖氨酸的药用价值极高。

目前投入生产的D-赖氨酸大都采用化学方法，化学法的缺点是经济效益不高，并且对环境的影响比较大。而生物酶法具有高效且对环境的影响较小的优点。因此，本课题采用双酶联合的生物方法来高效生产D-赖氨酸。首先利用赖氨酸消旋酶将L-赖氨酸消旋得到 DL-赖氨酸，然后再通过加入赖氨酸脱羧酶，对DL-赖氨酸进行拆分。在反应结束后，L-赖氨酸被全部转化为1,5-戊二胺。最终，D-赖氨酸的收率为48%，ee值高达99.9%。

关键词：D-氨基酸 D-赖氨酸 氨基酸消旋酶 赖氨酸脱羧酶

Production of D-lysine Catalyzed by a Two-Step Biocatalytic Cascade Of Amino Acid Racemase and Lysine Decarboxylase

Abstract

D-Lys is an important pharmaceutical intermediates in the development of new medicine.It has a good effect on antibacterial and anti-fungal properties.When we use D-Lys by administering oral medications and intravenous injection,we can reduce the absorption of renal radioactive peptide.It is more suitable for the treatment of cancer than L-Lys.D-Lys polymer is a good carrier of drugs.It can stimulate the proliferation of our cells in cartilage and brain astrocytes.

At present,the production of D-lysine are almost using chemical methods. However,these methods do harm to our environment and its economic efficiency is not too high.Therefore,our study involves too continuous reaction for the efficient production of D-lysine.First of all, L-lysine was racemized to give DL-lysine by whole cells containing amino acid racemase.Then eliminating AAR and adding the crude enzyme solutioncontaining lysine decarboxylase. At the end of the reaction L- lysine was completely converted to 1,5-diamine. The yield of D-lysine is 48%, the values of ee is up to 100%.

Key Words: D-amino acids; D-lysine; amino acid racemase; lysine decarboxylase

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 D-氨基酸的背景 1

1.2 D-赖氨酸的功能 1

1.3 D-赖氨酸的制备方法 2

1.4 本文的研究方向 2

1.5 本课题研究的意义 3

第二章 实验材料和方法 5

2.1 主要仪器 5

2.2 实验试剂 6

2.3 供试菌株 6

2.4 培养基 7

2.5 赖氨酸消旋酶基因合成及质粒构建 7

2.6 质粒转化到大肠杆菌的过程 7

2.7 大肠杆菌中质粒的提取 8

2.8 质粒酶切验证 9

2.9 SDS-PAGE方法 9

2.10 菌体生长测定（以OD₆₀₀表示） 9

2.11 培养方法 10

2.12 粗酶液的制备 10

2.13 产物测定方法 10

2.13.1 D-赖氨酸的高效液相色谱法检测方法 10

2.13.2 1,5-戊二胺的检测方法 10

2.14 酶活的定义与检测 11

2.14.1 赖氨酸消旋酶的酶活测定 11

2.14.2 赖氨酸脱羧酶的酶活测定 11

第三章 实验结果与讨论 12

3.1 重组质粒的鉴定 12

3.2 重组蛋白SDS-PAGE凝胶电泳 12

3.3 产物HPLC鉴定 13

3.4 双酶级联反应条件的优化 14

3.4.1 PH对酶活的影响 14

3.4.2 反应温度对酶活的影响 16

3.4.3 金属离子对酶活的影响 17

3.4.4 磷酸吡哆醛(PLP)添加量对赖氨酸脱羧酶酶活的影响 18

3.5 双酶级联反应结果 19

第四章 结论与展望 21

4.1 结论 21

4.2 展望 21

参考文献 22

致谢 26

第一章 文献综述

1.1 D-氨基酸的背景

氨基酸有D-氨基酸和L-氨基酸两种异构体。虽然氨基酸的两种异构体除了旋光性相反，其余性质基本相同，但是，它们在生物体内却发挥着不同的生理作用^[1]。

曾经认为生命物质中只存在L-氨基酸，因此曾导致生物学史上出现过一种错误的理论，即“存在着没有底物的酶”^[2]。

L-氨基酸主要存在于生物体内，而D-氨基酸在原核生物^[3]和真核生物中都有，这些生物包括酵母^[4]、哺乳动物^[5]、昆虫^[6]、植物^[7]。D-谷氨酸和D-丙氨酸在所有真菌的细胞壁中作为肽聚糖的成分存在。D-丝氨酸和D-天冬氨酸存在于哺乳动物的大脑中，并且在神经递质和激素调节中起到重要的作用。

除了甘氨酸外，组成人体内生命物质的20种氨基酸都有两种互成镜像的对映异构体 ^[8]，但是D-氨基酸具有的特殊功能和性质是L-氨基酸所不能取代的^[9]。D-氨基酸目前已被广泛应用于生理活性肽和抗生素的合成，其在食品和医药等领域中的潜在价值也正在被迅速的发掘，并发挥着越来越重要的作用^[1]。

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