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摘 要

产琥珀酸放线杆菌130Z能够在厌氧条件下利用电子进行丁二酸发酵，并且具有优秀的多种碳源的利用能力。pH及催化电压是菌株产酸的关键因素。在以碱式碳酸镁为pH缓冲剂，催化电压为-0.8V的条件下，菌株利用糖蜜生产丁二酸浓度达到最大值。优化后丁二酸最大浓度达到12.905 g/L, 产率为1.075 g L^–1 h^–1。

关键词：产琥珀酸放线杆菌130Z 糖蜜 丁二酸 生物电化学系统

Study on the Succnic Acid Production by Biological Electrochemical Synthesis with Actinobacillus succinogenes 130Z with Molasses

Abstract

Actinobacillus succinogenes 130Z is capable of succinic acid fermentation with electrons under anaerobic conditions, which have ability to use a variety of carbon sources. The pH and catalytic voltage are the key factors for the production of acid. Under the condition of catalytic voltage for -0.8V, strain utilize molasses to produce the maximum concentration of succinic acid with basic magnesium carbonate as a pH buffer. The final titer of pyruvic acid production was 12.905 g L^–1 with an overall yield of 1.075 g L^–1 h^–1.

Key Words: Actinobacillus succinogenes 130Z; Molasses; Succinic acid; Biological electrochemical system

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 引言 1

1.1 课题研究背景 1

1.1.1 丁二酸的概述 1

1.1.2 糖蜜的背景及开发应用现状 2

1.1.3 电化学的概述 2

1.1.4 菌种 2

1.2 检测方法 4

1.2.1 有机酸含量的测定 4

1.2.2 糖含量的测定 4

1.2.3 电化学数据的采集 4

1.3 电化学装置 4

第二章 材料与方法 6

2.1 实验器材和药品 6

2.1.1 实验器材 6

2.1.2 实验试剂 7

2.1.3 培养基 8

2.2 实验方法 9

2.2.1 可行性验证实验 9

2.2.2 单糖、混合糖和糖蜜电化学实验 10

2.2.3 电压优化 10

第三章 结果与讨论 11

3.1 可行性验证实验 11

3.1.1 冻存管接种 11

3.1.2 4%菌液接种 12

3.1.3 20%菌液接种 13

3.1.4 50%菌液接种 14

3.1.5 pH缓冲体系 15

3.1.6 小结 16

3.2 单糖、混合糖及糖蜜电化学实验 16

3.3 电压优化 19

3.4 结论 20

参考文献 21

致谢 24

第一章 引言

1.1 课题研究背景

1.1.1 丁二酸的概述

丁二酸（succinic acid），又称琥珀酸，因存在于琥珀中而得名^[1]，分子式为C₄H₆O₄，分子量为118.09。纯净的丁二酸是无色单斜棱柱状结晶体，分为α型和β型两种晶体。丁二酸溶于水、乙醇和乙醚；不溶于氯仿、二氯甲烷等有机溶剂^[2]。丁二酸可以参与很多化学反应，包括氧化反应、还原反应、酯化反应、卤化反应等^[3]。

丁二酸是工业上的一种重要的四碳化合物，它作为有机合成原材料、中间产物或专用化学品广泛应用在食品、医药、农药、染料、香料、油漆、塑料和材料工业^[4]。在食品行业中，丁二酸因为有贝类特有的鲜味，广泛应用于清酒、黄酒等酒类和酱油、发酵食品和调味料^[5]。在医药行业中，丁二酸可以用作防腐剂、pH值调节剂、助溶剂，还可以用来合成解毒剂、利尿剂、镇静剂、止血药、合成抗生素以及维生素A、维生素B等，另外因为是TCA循环的中间产物之一，在生物代谢中有很重要的地位，所以丁二酸也被广泛应用于合成化学药物的中间体^[6]。在化学行业中，丁二酸也是良好的离子螯合剂和表面活性剂。同样在农业行业中，丁二酸也在处理种子提高发芽率、除草剂的添加剂中有广泛的应用。

目前，丁二酸的生产方法主要有：化学合成法、生物转化法以及微生物发酵法。化学合成法主要在工业上利用，包括石蜡氧化法、催化加氢法以及电化学合成法^[7]。目前，国内外主要使用顺酐电化学合成法。电化学合成法有电耗大、离子膜易破损阳极消耗严重、工艺条件操作不佳等许多问题^[7]。生物转化法是以富马酸为底物，通过富马酸还原酶的催化作用生成丁二酸^[8,9]。这是一条新的途径，但是因为使用大量的底物富马酸，其生产的经济性还有待深入研究。发酵法制备丁二酸是指以淀粉，葡萄糖等糖类或乳清等原料，通过微生物发酵的方法生产^[4]。发酵法是一个新兴的、有很大发展潜力的绿色工艺，避免了传统化学合成法的石化原料的消耗，生产过程环境友好，还能固定二氧化碳，缓解温室效应。

1.1.2 糖蜜的背景及开发应用现状

甘蔗糖蜜是制糖工业的副产物，其产量约为甘蔗原料的2-4%^[10,11]，是甘蔗汁经过加热、中和、沉淀、过滤、浓缩、结晶等步序所剩下的粘稠液体，即为我们常提到的糖蜜，属于液体能量饲料，主要含蔗糖、还原糖、色素、胶体以及无机灰分等物质^[12]。

由于甘蔗糖蜜价格低廉，且资源化利用简单，因此在很多行业都有应用。在欧美以及亚洲一些地区，甘蔗糖蜜因为消化吸收快、适口性高等优点被普遍作为一种物美价廉的饲料原料^[13,14]。把糖蜜作为常用饲料喂养奶牛，能明显提高牛乳产量和质量^[15]。甘蔗糖蜜中的蔗糖和还原糖都是可以被微生物利用的氮源，只需除去其中的有害物质，补充适量的氮源和碳源，就可以直接利用。同时甘蔗糖蜜中有35%左右的蔗糖未结晶出来，对这部分糖加以利用，不但可以提高糖产量，还可以降低糖蜜产生量。糖蜜还可以用作焦糖色素的原料^[16]，是一种优质的天然色素。

1.1.3 电化学的概述

生物电化学系统（BES）是指一类在电化学系统阳极和阴极至少有一侧电化学反应是在微生物的催化作用下进行^[17]。最早的BES是以微生物燃料池（MFC）的概念出现，后来改为了微生物电解池（MEC）。MEC是为微生物代谢提供还原力的一种方式，通过外源电压输入作用于生物阴极，为微生物提供电子，产生还原力。MECs 主要被用于发酵产氢、还原性产物生成以及生物降解等方面^[18,19]。

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